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卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤,发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌,严重危害女性的生命健康。卵巢癌是高度异质性肿瘤,组织学亚型较多,不同类型的卵巢癌在形态特征、临床表现、遗传改变、肿瘤行为等方面均表现出一定的差异,且难以在早期发现,易发生转移、化疗耐药、复发,使卵巢癌的诊断和治疗都面临着极大的挑战。卵巢癌的致病机理十分复杂,至今仍未完全阐明。一般的观点认为卵巢癌的发生既与卵巢特殊的解剖结构、机械刺激等有关,也与卵巢微环境中生长因子、黏附因子、免疫炎性反应因子等的功能失调而导致细胞内信号分子发生异位、突变、丢失、结构重排等使细胞的正常生长、增殖、分化、凋亡失控而引起细胞恶性转化相连。神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是一种多效性的肽类激素,通过与靶细胞表面的高亲和力受体TrkA和低亲和力受体P75结合来调控细胞的存活、生长、分化、凋亡等生理活动,对机体正常生理状态和病理发展有重要的影响。近年来的大量研究发现:NGF及受体(Nerve growth factor receptors,NGFRs)在乳腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤等恶性肿瘤中广泛表达,异常表达的NGF/NGFRs影响肿瘤的发生、生长、增殖、分化、侵袭、转移、预后等过程。NGF/NGFRs在正常卵巢组织中低表达,能调节垂体分泌卵泡刺激素(Follicle-Stimulating Hormone,FSH)及卵巢上皮表面FSH受体水平、卵泡发育、排卵等卵巢正常生理功能,异常表达的NGF/NGFRs会引起卵泡刺激素分泌紊乱,导致上皮性卵巢癌的启动和发生。但NGF/NGFRs参与卵巢癌的启动、发生、发展及作用机理等方面的知识了解甚少,作用机制尚未完全阐明。因此,深入了解NGF/NGFRs对卵巢癌细胞生物学行为的影响及相关分子机制,对卵巢癌的预防、诊断、治疗、预后等有重要意义。本文的主要研究内容包括:(1)考察NGF/NGFRs在卵巢癌细胞系中的表达。采用定量RT-PCR和Western blot法检测常规培养(含10%胎牛血清的完全培养基)条件下NGF/NGFRs在卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、OVCAR3、CAOV3中的表达情况。结果显示:NGF/NGFRs均同时在这几种卵巢癌细胞中表达,内源性的NGF在OVCAR3、CAOV3细胞中表达水平较高,为后续实验奠定了细胞学基础。(2)考察NGF/NGFRs对卵巢癌细胞存活、生长、增殖、细胞周期、生长节律、凋亡的影响。采用细胞行为学观察实验、定量RT-PCR、Western blot等方法检测NGF/NGFRs对卵巢癌细胞存活、生长、增殖、细胞周期、生长节律、凋亡相关基因和蛋白表达的影响。通过特异性的NGF/NGFRs抑制剂阻断NGF/NGFRs的作用,考察NGF/NGFRs在卵巢癌细胞存活、生长、增殖、细胞周期、生长节律、凋亡中的作用。结果显示:NGF下调CAOV3和OVCAR3细胞中SIRT1(Sirtuin1)、Survivin的表达水平,减弱卵巢癌细胞的存活能力;NGF上调CAOV3和OVCAR3细胞中Ki67、PPARδ,下调PCNA的表达水平,抑制卵巢癌细胞的增殖能力;NGF上调CAOV3和OVCAR3细胞中Cyclin E1、P21,下调Cyclin D1的表达水平,影响卵巢癌的周期调控,促进卵巢癌细胞的凋亡;NGF下调CAOV3和OVCAR3细胞中Clock、FBXL3的表达水平,影响卵巢癌细胞的生长节律,但具体的生物学效应还需要进一步深入研究;NGF上调CAOV3和OVCAR3细胞中P53、BCL2、Caspase9,下调Caspase3、Caspase7的表达水平,上调CAOV3细胞中CYCS的表达而下调OVCAR3细胞中的CYCS,下调CAOV3细胞中BAX的表达而上调OVCAR3细胞中的BAX,影响卵巢癌细胞的凋亡过程。(3)考察NGF/NGFRs对卵巢癌细胞粘附能力的影响。采用细胞粘附实验、定量RT-PCR、Western blot等方法检测NGF/NGFRs对卵巢癌细胞粘附能力、紧密连接相关基因m RNA和蛋白表达的影响。结果显示:NGF上调CAOV3和OVCAR3细胞中紧密连接蛋白CLDN3、CLDN4的表达水平,下调CAOV3细胞中紧密连接蛋白CLDN1的表达而上调OVCAR3细胞中的表达水平,影响卵巢癌细胞间的连接状态,NGF/NGFRs的抑制剂能阻断这种作用。结果表明:NGF/NGFRs能通过调节卵巢癌细胞间的紧密连接状态而参与卵巢癌细胞成团、运动能力的调节。(4)考察NGF/NGFRs对卵巢癌细胞迁移能力的影响及分子机制。利用Transwell小室及本实验室自行构建的微流控芯片考察NGF对卵巢癌细胞迁移行为的影响;通过定量RT-PCR、Western blot法检测NGF对WNT/β-catenin信号通路中的关键因子β-catenin及下游靶基因CD44、C-myc、MMP2、MMP7、TIMP2等表达的影响,考察NGF影响卵巢癌细胞迁移能力变化的分子机制。结果显示:不管是在二维培养还是三维培养条件下,NGF均能影响CAOV3和OVCAR3的迁移能力;NGF对经典WNT/β-catenin信号中的关键分子及下游靶基因的表达有影响,NGF可通过激活或调控WNT/β-catenin信号通路影响卵巢癌细胞的迁移。NGF对不同卵巢癌细胞迁移变化的影响有一定的差异性,说明NGF对卵巢癌细胞的生物学效应有细胞特异性。综上所述,我们得出以下结论:NGF/NGFRs在选择的这几种上皮性卵巢癌细胞系中均表达;NGF能调节卵巢癌细胞的存活、生长、凋亡相关基因的表达水平,影响卵巢细胞的周期和生长节律;NGF能调节卵巢癌细胞中紧密连接蛋白CLDN1、CLDN3、CLDN4的表达,影响卵巢癌细胞之间的连接状态,参与卵巢癌细胞的转移过程;NGF可通过经典的WNT/β-catenin信号通路介导卵巢癌细胞的迁移行为。以上实验结果表明:NGF/NGFRs对卵巢癌的生物学行为有重要的调节作用,深入研究NGF/NGFRs对卵巢癌细胞的影响有助于阐明生长因子、细胞因子在卵巢癌发生和发展中的作用机制,提高卵巢癌的诊断、治疗水平和预后效果。