【摘 要】
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甘薯潜隐病毒莲藕分离物(sweet potato latent virus-lotus,SPLV-lotus)2017年首次在莲藕上发现。SPLV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus),与甘薯潜隐病毒甘薯分离物(sweet potato latent virus-sweet potato,SPLV-sp)具有显著的序列多样性。为了建立SPLV-lotus
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甘薯潜隐病毒莲藕分离物(sweet potato latent virus-lotus,SPLV-lotus)2017年首次在莲藕上发现。SPLV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus),与甘薯潜隐病毒甘薯分离物(sweet potato latent virus-sweet potato,SPLV-sp)具有显著的序列多样性。为了建立SPLV-lotus的血清学检测体系,本研究从感病的莲藕样品中克隆出SPLV-lotus外壳蛋白(CP)基因,通过原核表达并纯化了 SPLV-lotus的CP蛋白。使用纯化的CPSPLV-lotus重组蛋白免疫新西兰大白兔,以产生具有特异性的多克隆抗血清。基于SPLV-lotus CP蛋白抗血清,本研究建立了 Dot blot和ELISA两种快速、灵敏、高通量的血清学检测方法。研究结果表明,制备的SPLV-lotus的CP抗血清与SPLV-sp的CP抗血清交叉反应性弱,各自的特异性高,两者在莲藕和甘薯的田间检测中无法混用。RNA沉默是植物中普遍存在的抗病毒防御机制,而病毒在长期的进化过程中,逐渐进化出抵抗寄主RNA沉默的策略。例如,病毒通过编码RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressor,RSS)的方式,在植物基因沉默的不同通路、不同节点抑制寄主的免疫反应,来阻断或干扰植物抗病毒沉默的能力,从而达到对寄主植物系统侵染的目的。本实验研究SPLV-lotus编码的HC-Pro是否为RNA沉默抑制子和致病决定因子。首先,本研究通过农杆菌浸润本生烟瞬时表达HC-ProSPLV-lotus,于紫外灯下观察ssGFP荧光激发情况来确定HC-ProSPLV-lotus蛋白的沉默抑制活性。实验结果表明HC-ProSPLV-lotus是SPLV-lotus编码的基因沉默抑制子,能够有效抑制ssRNAs引起的局部沉默和系统沉默,但不能抑制dsRNAs引起的局部沉默。本实验又将HC-ProSPLV-lotus构建到PVX载体上得到PVX-HC-ProSPLV-lotus并通过农杆菌浸润本氏烟叶片,发现其能显著地增强PVX的致病性,说明SPLV-lotus编码的HC-Pro也是其致病决定因子。本研究首次发现HC-ProSPLV-lotus蛋白在细胞质和细胞核均有分布,并且通过软件预测发现HC-ProSPLV-lotus具有两个核定位信号。当突变预测的HC-ProSPLV-lotus的核定位信号,HC-ProSPLV-lotus RNA沉默抑制活性显著降低并且HC-ProSPLV-lotus致病力也会下降。为了探究SPLV-lotus的HC-Pro如何发挥RSS作用,本研究通过酵母双杂交、双分子荧光互补、戊二醛交联等互作实验初步证明HC-ProSPLV-lotus不能自身互作形成二聚体,但似乎能形成多聚体,进一步研究也证明其也不能与拟南芥的AGO1互作,因此尚需要进一步实验明确其基因沉默的抑制策略。本研究提供了一系列基于血清学的高通量、灵敏、快速的诊断方法,用以检测SPLV-lotus。同时本研究针对SPLV-lotus编码的HC-Pro的生物学功能进行了初步探究,为从分子水平理解SPLV-lotus的致病性及莲藕田间有效防控提供理论基础。
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