论文部分内容阅读
背景:牙周膜细胞中含有多种细胞成分,体外培养的牙周膜细胞具有成纤维细胞的形态,又称为牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLFs),PDLFs是牙周膜中数量最多,功能最重要的细胞。在一生中,牙周膜成纤维细胞不断形成新的主纤维、牙骨质并改建牙槽骨,一旦牙周膜成纤维细胞在数量上减少或结构破坏,可能导致牙周支持组织的损害,进一步诱发并加重牙周组织疾病的发生。牙周膜成纤维细胞具有合成细胞外基质的功能,细胞外基质不仅是细胞的支持物,本身同样具有独特的生物学作用,如参与细胞的粘附、迁移、分化及牙周附着等重要过程。研究发现慢性牙周病时牙齿松动,除牙周组织胶原的降解、牙槽骨的吸收破坏外,牙周膜成纤维细胞再生功能降低也是不可缺少的原因之一。因此,对牙周膜成纤维细胞增殖、分化活性的研究,对牙周疾病病因学和治疗学的了解和发展均起到重要的作用。高原环境下空气稀薄、含氧量低,特别是随海拔高度的升高,血液流变性“浓、粘、聚”发生改变,导致组织不同程度缺氧,缺氧是机体最常见的病理生理过程。研究表明,机体对缺氧的反应实际上均为细胞对缺氧的反应所致。目前,国内、外对于高原地区牙周疾病的研究极少,仅见局部地区小范围、小样本的流行病学方面的调查。而针对高原特殊环境下,缺氧对口腔卫生健康,以及口腔疾病发生、发展和转归方面等研究少见报道。本研究体外成功获取人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPLFs),观察不同程度缺氧对体外HPLFs增殖、矿化的时间效应以及细胞超微结构的影响,以探讨高原缺氧时HPLFs的生物学变化及其意义,为高原牙周疾病深入研究提供实验依据。目的:体外培养HPLFs作为研究对象,模拟不同缺氧条件,观察其对牙周膜成纤维细胞增值、矿化的时间效应以及细胞超微结构的影响,了解不同缺氧对牙周膜成纤维细胞增殖、分化活性的影响,探讨高原不同程度缺氧时HPLFs的生物学变化及其意义,为高原牙周疾病深入研究提供实验依据。材料和方法:1、体外培养并建立稳定的HPLFs细胞,鉴定细胞来源,以及对细胞进行形态学观察。取10～14岁因正畸所拔除的牙齿,用刀片仔细刮下根中1/3的牙周膜组织,剪成1 mm3大小的组织块,用探针移入培养瓶内培养。当原代细胞铺满瓶底约80-90%时,按1: 3比例传代培养。每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况和细胞形态。采用ABC法鉴定细胞来源,并绘制细胞生长曲线。2、将分离培养的第5代HPLFs细胞,随机分别置于三气培养箱(缺氧组)和5%普通二氧化碳孵箱(正常对照组)环境中培养。缺氧组充入氮气和二氧化碳,设定参数在37℃,O2浓度分别是10%、5%、2%,CO2浓度5%,饱和湿度,三气培养箱环境中进行轻、中、重度缺氧培养;对照组充入二氧化碳,设定参数在37℃、O2浓度是21%,5%普通CO2孵箱中培养,分别培养0、12、24、48、72 h后进行观察。3、取正常和缺氧环境下培养的细胞,在酶联免疫检测仪上,采用MTT法检测各组光吸收值(A490nm),比较HPLFs增殖活性的变化;利用考马斯亮蓝测定法检测细胞蛋白质合成;按碱性磷酸酶试剂盒说明方法,测定各组碱性磷酸酶活性的含量。计算公式: =标准管吸光度测定管吸光度×标准管含酚的量÷取样量中蛋白克数4、将接种好的第5代HPLFs细胞置于正常和缺氧2%环境下培养,正常组培养72 h,缺氧分别培养24 h、48 h、72 h后进行实验,透射电镜下观察细胞超微结构变化。结果:1、采用组织块法培养,体外成功获取HPLFs。培养10天左右,细胞游出以组织碱性磷酸酶( U / g prot )块为中心呈放射状排列生长;培养约两周,绝大多数细胞呈梭形,同时也可见少量扁平的多角形细胞呈簇状生长,此为上皮样细胞。传代后牙周膜成纤维细胞呈星形、长梭形,胞体丰满,胞浆均匀,有2～3个突起,核圆形或卵圆,核仁清晰,细胞排列成束状或旋涡状。免疫组化染色表明细胞来自中胚层成纤维细胞。生长曲线近似倒“S”形,有明显的滞留期,指数生长期和平台期。4～7代内处于指数生长期HPLFs细胞,增殖旺盛,活性最佳,适用于实验研究。2、与对照组相比,12 h、24 h,缺氧组细胞生长呈增殖趋势,并随缺氧程度加重细胞保持较强的增殖,重度缺氧组24 h光吸收值增加(P<0.05); 48 h重度缺氧组细胞增殖受到抑制,吸光度值与对照组相比降低( P< 0.05);培养72 h,中、重度缺氧组细胞增殖较对照组呈明显抑制作用(P<0.05 P<0.01)。细胞蛋白质表达与细胞增殖的变化趋势基本相一致,重度缺氧24 h,促进了细胞蛋白质的合成,培养48 h、72 h,细胞蛋白质合成则较对照组呈明显降低(P<0.05,P<0.01)。3、所有组细胞的ALP活性随时间呈抑制趋势,与对照组比较,中、重度缺氧对细胞碱性磷酸酶活性表达随缺氧时间则明显受到抑制(P<0.05 P<0.01)。4、透射电镜下,对照组胞浆内有丰富的细胞器,可见粗面内质网和线粒体,有细胞突起,细胞核明显,核膜清楚。细胞缺氧24 h,胞浆内粗面内质网和线粒体明显增多,二者轻度扩张、膜结构完整,细胞突起增多,细胞核大,或可见双核,不规则,常染色质分布均匀。缺氧48 h组可见细胞内粗面内质网和线粒体减少,线粒体嵴稀疏,内质网肿胀、紊乱、断裂,细胞突起减少。72 h缺氧组,细胞发生退变,粗面内质网和线粒体较少,细胞突起少,内质网有不同程度脱颗粒现象,溶酶体增多,甚至成囊泡样变,膜结构破坏。结论:1、采用组织块法可成功获取HPLFs细胞。方法简便、易行,可靠,可以作为体外HPLFs实验研究模型。2、HPLFs的增殖受到缺氧时间、程度的影响,短期缺氧促进了HPLFs代谢和蛋白质的合成,随缺氧程度加重及时间的延长,HPLFs的增殖明显受到抑制,蛋白含量显著降低,从而影响牙周膜的改建和修复。3、HPLFs的ALP活性表达与缺氧时间、程度存在效应关系,轻度缺氧对细胞ALP活性影响较小,长期中、重度缺氧不利细胞向成骨方向分化,牙周组织再生功能下降。4、细胞超微结构显示,随缺氧时间的延长,重度缺氧条件下HPLFs生长受到明显抑制,细胞形态结构遭到破坏,功能低下。5、长期中、重度缺氧条件下HPLFs增殖、蛋白合成及矿化功能降低,提示牙周膜再生修复低下,可能加重牙周组织破坏程度,诱发牙周病的发生。