放线菌WT1抗真菌活性物质的发酵和提取

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WT1是本实验室有从土壤中分离到的一株放线菌。该菌株能产生抗植物真菌病害的代谢物。通过测定抗菌谱,发现其对7种植物病原真菌有显著拮抗作用,但是对几种细菌均无作用。本文对放线菌WT1抗真菌活性物质的发酵和提取进行了研究。 ⑴采用单因素法优化培养基组成,分别对氮源、碳源、无机盐进行优化。采用酵母粉、黄豆粉、麸皮、硫酸铵、尿素作为单一氮源取代原始发酵培养基中的氮源(其他条件不变)进行发酵实验,在其中选出最适宜用作氮源的物质。采用葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖作用单一碳源取代原始发酵培养基的碳源进行发酵实验,在其中选出最适宜用作碳源的物质。最后得出最佳氮源、碳源、无机盐分别为黄豆粉、玉米粉、磷酸二氢钾、碳酸钙。采用正交试验确定氮源、碳源、无机盐的最佳配比。以优化后的培养基进行发酵条件的优化,测定不同发酵时间、培养基初始PH、发酵温度下发酵液对香蕉枯萎病菌的抑菌活性变化。从而分别得到最佳的发酵时间、培养基初始PH、发酵温度。试验结果表明,最佳发酵培养基和发酵条件为:黄豆粉1%、玉米粉4%、碳酸钙0.3%、磷酸二氢钾0.04%,温度28℃、初始PH7.5、发酵72小时。抗生素稳定性试验表明:WT1所产生的抗真菌活性物质有较好的温度稳定性;在pH酸性的条件下稳定,在碱性条件下较不稳定。 ⑵发酵液的预处理方法为:用草酸将发酵液调至4.0,静置30min,4000rpm,10min离心取上清。上清液pH调回7.0,以D152树脂进行第一步的分离。穿透曲线测定表明:100ml D152树脂可以完全吸附500ml预处理过的发酵液。以稀盐酸进行洗脱,550ml发酵液过柱,可以得到500ml的洗脱液。洗脱液对香蕉枯萎病的抑菌圈平均为20mm左右。将D152洗脱液浓缩10倍,使用丙烯葡聚糖凝胶层析柱过滤,检测波长为318nm。在缓冲液过柱体积为60ml左右时,出现一个洗脱峰。收集后浓缩做抑菌试验有抑菌活性,证明该洗脱峰有活性物质。高效液相色谱检测表明:活性物质保留时间为1.5min,含量90%左右。紫外光谱扫描结果表明:活性物质在波长291、304、320均有典型四烯发色基团的吸收峰,说明该活性物质为四烯类抗生素。
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