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地衣是一类专化型的真菌与藻类及/或蓝细菌的互惠共生的生态系统。地衣化赋予地衣型真菌很多独特的生物学特性,例如极强的抗逆能力。不同于其它被广泛研究的真核生物,在分子生物学水平上对地衣型真菌的了解甚少。造成这种现状的原因很多,例如地衣型真菌缓慢的生长速度及共生菌、藻分离困难等。目前的地衣生物学研究由于缺少遗传操作系统,几乎不能实现其基因功能的体内验证。然而,想要破解地衣的遗传信息首先要从地衣型真菌或其光合共生物的基因组测序工作开始。 本研究所采用的地衣型真菌材料是石果衣(Endocarpon pusillum),它分离自干旱荒漠地区的优势地衣,其共生藻为柯氏复球藻(Diplosphaera chodatii)。为了探究地衣化对地衣型真菌的影响及抗旱的分子机制,我们对石果衣真菌的基因组和转录组进行测序。主要研究结果如下: (1)石果衣真菌基因组测序拼接成37.5 Mb的基因组,预测出9,285个基因。生物信息分析结果为揭示地衣型真菌的一些生物学特性提供了分子证据,例如:同宗结合繁殖方式和抗旱基因的注释。比较基因组分析指出石果衣真菌中一些蛋白家族的进化揭示了菌、藻之间的互作关系。石果衣共生菌、藻的共培养实验验证一些涉及共生体间碳、氮传递的基因的表达变化,以及三个无信号肽的凝集素基因在菌、藻识别过程中的表达变化。同时,确定了共生菌、藻合适的生物量比例及接触时间。 (2)比较转录组分析找到1,781个在PEG诱导干旱胁迫条件下差异表达的基因。参照其它抗旱真菌和植物,一些通用的抗逆机制基因在石果衣真菌中也是差异表达的,然而,有关渗透压调节机制的基因的表达变化在石果衣真菌中不同,而且,不同于其它真核生物,一些干旱适应机制的基因在石果衣真菌中为差异表达基因,说明石果衣真菌可能是干旱适应物种。荧光定量实验验证了23个转录组中差异基因在地衣体自然脱水过程中的表达变化,结果说明共生状态和分离培养状态下的石果衣真菌抗旱机制大体一致。 (3)为了进一步研究石果衣真菌的抗旱机制,利用双向电泳、质谱技术结合的方法,对PEG诱导干旱胁迫条件下的石果衣真菌进行了差异蛋白质组的比较分析。实验中对蛋白质样品制备方法进行了优化,找到合适的地衣型真菌蛋白质组提取方法。2DE图谱分析结果表明,在干旱胁迫条件下,共检测到58个蛋白丰度差异表达变化在1.5倍以上的蛋白点。其中49个蛋白点通过MALDI-TOF-TOF分析得到有效鉴定。但是,只有22%的基因在蛋白质水平和转录水平有较高的一致性,说明石果衣真菌抗旱相关基因大部分是受复杂的翻译后修饰作用调控的,值得进一步的深入研究。 本研究在基因组水平上揭示石果衣真菌的生物学特性提供信息,并对石果衣共生菌、藻之间识别和互作进行初步研究,有利用进一步深入研究地衣型真菌抗旱性分子机制,本研究所取得的结果将为开展地衣功能基因组学奠定基础。