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4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)是一种天然的非蛋白质氨基酸,具有促胰岛素分泌的生物活性。异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)能催化L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)C-4羟基化生成4-HIL,同时将α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,KG)转化成琥珀酸(succinate,Suc)。本论文从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT 1520中克隆IDO编码基因(ido),并将其表达在Ile生产菌谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种(Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum)中,通过“一步法”发酵将内源Ile直接转化成4-HIL。主要研究内容和结果如下:1.克隆B.thuringiensis YBT 1520异亮氨酸双加氧酶基因ido及其截短基因idoΔ6,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中分别进行过量表达、纯化和酶学性质的测定。Ido、IdoΔ6的最适p H均为6.0,在p H 5.5-7.5之间稳定性较好;最适温度为40 oC,热稳定性较差。在最适条件下Ido、IdoΔ6的酶活分别是0.93±0.07、1.50±0.07 U/mg,Ido对底物Ile和KG的Km值分别为1.63、1.22 m M,IdoΔ6的分别是2.69、2.52 m M。与Ido相比,IdoΔ6对底物Ile的催化效率提高了31.8%,对底物KG的催化效率却降低了41.3%。2.构建了ido表达菌C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01/p JYW-4-ido,摇瓶发酵144 h之后4-HIL产量达到50.99±2.14 m M。随后考察了玉米浆限制与4-HIL产量的关系,结果表明在玉米浆亚适量(7 g/L)条件下4-HIL的产量提高到65.44±2.27 m M,明显高于玉米浆充足、缺乏条件下4-HIL的产量,且Ile到4-HIL的转化率达到0.85mol/mol。生物素限制实验进一步证明了在生物素亚适量条件下4-HIL产量明显高于其它条件下的产量。3.构建了idoΔ6表达菌C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01/p JYW-4-idoΔ6,摇瓶发酵对比SN01/p JYW-4-ido、SN01/p JYW-4-idoΔ6在最佳玉米浆(7 g/L)条件下的4-HIL产量。结果表明ido表达菌4-HIL产量(65.44±2.27 m M)明显高于idoΔ6表达菌4-HIL产量(48.91±2.92 m M)。为此研究了重组菌中Ido和IdoΔ6的蛋白表达量和发酵温度下(30 oC)的酶学特性,结果表明两种蛋白的表达量和酶学特性均没有明显差异。最后测序发现p JYW-4-idoΔ6的rbs序列中出现一个碱基的替换(AGAAGGAG→AGAAGGGG),这可能是造成4-HIL产量差异的主要原因,有待进一步研究。本研究建立了一个4-HIL从头生物合成系统,并发现玉米浆限制可以作为提高4-HIL产量的有效策略。