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目的：细胞水平、整体水平两个层次相结合，再辅以结构预警，建立中药成分肝毒性筛选方法；通过对细胞活力、细胞生物膜完整性、细胞形态、细胞能量代谢、细胞坏死/凋亡相关指标的检测，建立中药成分在细胞水平上的肝毒性机制筛选平台：建立肝肾细胞共培养体系，以探求中药成分及其代谢产物对肝细胞的选择性。
方法：(1)用MTT法检测给药一段时间后肝细胞的活力，用全自动血液生化仪检测肝细胞培养上清液中ALT，AST，ALP，BUN，Cr，LDH水平；整体实验研究静脉给予药物7d后小鼠血清中肝功能的变化和药物对小鼠肝组织病理学的影响，并探讨实验结果与数据库预测结果的相关性。(2)采用电镜观察给药后细胞亚显微结构的变化。(3)采用ELISA法检测给药后细胞内cAMP和cGMP的含量。(4)采用Hochest33342和PI双标染色，检测不同时间给予药物和给予不同剂量的药物后，细胞的凋亡和坏死情况。(5)采用western blot法检测给药后细胞中c-Jun和c-Fos蛋白的表达。(6)采用MTT法比较药物在肝肾单独培养和共培养体系中对肝、肾细胞活力的影响。
结果：(1)中药结构预警数据库+细胞水平实验+整体水平实验：在中药成分的筛选研究中，通过细胞水平毒性实验、整体水平验证，再结合结构预警进行预测的方法来评价其毒性是可行的。其中，细胞水平实验：雷公藤中，雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱和雷公藤红素对肝细胞均有一定毒性作用，其中5ng/ml雷公藤甲素即可引起肝细胞损伤，所以它可能是雷公藤致肝毒性的物质基础之一；山豆根所含的主要成分苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞均有一定毒性作用，且肝细胞毒性苦参碱(0.625mg/ml)氧化苦参碱(1.25mg/ml)，所以苦参碱可能是山豆根致肝脏毒性的物质基础之一；吴茱萸中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱对肝细胞有一定毒性作用，且作用吴茱萸次碱(2μg/ml)吴茱萸碱(5μg/ml)，吴茱萸内酯和辛弗林对肝细胞几乎没有任何影响，所以吴茱萸次碱可能是吴茱萸致肝脏毒性的主要毒性成分之一。(2)电镜观察显示，苦参碱和商陆皂苷甲剂量越大对肝细胞亚显微结构的改变越大。(3)ELISA法结果显示，给予苦参碱和商陆皂苷甲24h后，随着给药剂量的增加，cAMP/cGMP的比值不断降低。(4)PI和Hochest33342双标染色结果显示，大剂量的苦参碱可能会导致肝细胞的凋亡，大剂量的商陆皂苷甲可能会导致肝细胞的快速凋亡或死亡。(5)western blot结果显示，苦参碱和商陆皂苷甲均能上调c-Jun和c-Fos的表达。(6)肝肾共培养体系不仅能替代单独培养体系进行体外实验，同时还能够体现出药物对肝细胞的选择性。
结论：中药成分的肝毒性综合评价可以先通过1)“细胞水平上进行细胞毒性实验一整体水平上进行验证”两个层次相结合，最后与结构预警数据库的预测结果相比较，建立中药成分肝毒性筛选平台。2)对“细胞活力、细胞生物膜完整性、细胞形态、细胞能量代谢、细胞坏死/凋亡相关指标”的检测，建立中药成分肝毒性机制评价体系。在肝毒性机制研究中显示，大剂量的苦参碱和商陆皂苷甲可能通过死亡受体通路引起细胞凋亡；肝肾共培养体系不仅能替代单独培养体系进行体外实验，同时还能够体现出药物或其代谢产物对肝细胞的选择性。