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蛇类在世界范围内分布广泛,种类繁多,在中国大陆已发现200多种蛇种及54种亚种。因此,对蛇毒中富含的生物活性成份研究与开发一直是基础医学和制药工业关注的重要研究领域。近年来,研究者分离纯化出一些蛇毒中的酶类及神经毒素等活性物质,其生物活性也得到了应用。但蛇毒中的多种蛋白成分及其生物活性功能仍不为人类所了解。与国际研究水平相比,国内至今只对其中少数几种粗毒或部份纯化的蛋白组分进行了抗肿瘤作用研究,绝大部分蛇毒抗肿瘤成分都没有被发掘出来。本论文以我国华南地区广西常见的眼镜蛇毒为分离样品源,进行了蛇毒蛋白的纯化、分离,检测其抗肿瘤活性,对眼镜蛇毒各组分进行跟踪筛选与评价,旨在为发现具有临床应用价值的抗肿瘤作用活性物质打下理论基础。首先,选取眼镜蛇、蝮蛇、金环蛇和蟒蛇为原料,检测四种蛇毒对人肝癌HepG2细胞生长的抑制作用,确定这四种蛇毒的抗癌活性作用依次减弱；利用MTT法检测眼镜蛇毒和蝮蛇毒的半数抑制浓度(IC50)分别为5.12和22.50μg／mL,而蟒蛇毒和金环蛇毒的IC50均大于100μg／mL。选择抗肿瘤活性作用最为明显的眼镜蛇毒做进一步研究。利用FOCUSTM-Mammalian Proteome试剂盒结合真空浓缩离心系统处理,得到蛇毒粗纯蛋白样品。眼镜蛇毒粗纯蛋白对人肝癌HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50)为1.07μg／mL。眼镜蛇毒和蛇毒粗纯蛋白对人肝正常HL-7702细胞有一定的细胞毒性,并对比肿瘤细胞的IC50值,确定蛇毒粗纯蛋白选择性更强。为研究蛇毒粗纯蛋白抑制肿瘤细胞增殖的时效和量效关系,本实验绘制蛇毒粗纯蛋白处理后HepG2细胞的生长曲线,结果显示其可浓度和时间依赖性的抑制肿瘤细胞增殖。采用吖啶橙染色进行形态学观察,发现细胞形态呈时间和浓度依赖性变化,低浓度蛇毒粗纯蛋白处理组细胞圆缩、贴壁能力下降,密布黄绿色芽孢状突起；各组细胞核或细胞质内可见致密的黄绿色荧光,甚至可见浓染的黄绿色碎片,呈现细胞凋亡形态学变化；在高浓度处理组有一定的坏死细胞出现,细胞膜破裂,呈弥散状。以Tris-HCl缓冲液(20mM, pH8.0)为洗脱体系,用0-0.5M NaCl的Tris-Hcl溶液进行线性梯度洗脱,洗脱流速为0.5 mL/min,建立眼镜蛇毒粗纯蛋白的离子交换层析分离方法,紫外检测波长280nm,共得到四个吸收峰,其中一、二两个洗脱峰是蛇毒粗纯蛋白的主要成分。进一步采用高效液相比较分析各洗脱峰下所对应馏分的蛋白洗脱模式。各馏分的液相分析选用反相柱(Lichrospher C18,150×4.6 mm,5μm i. d.),上样量20μL,流动相为A (0.1%v/v TFA,98%v/vACN),流动相B (0.1%v/v TFA,2%v/v ACN),按14.7%-88.2% ACN(15-90%流动相A)比例进行梯度洗脱,流速为0.8 mL/min,紫外全波长扫描。第一洗脱峰,馏分9-12,含有多种蛋白成分,其中两类疏水性、紫外吸收特性各异的蛋白混合物含量较高,而另外三个吸收峰分别存在单一蛋白,它们的疏水性及光谱特性均有所不同。以牛血清白蛋白为标准,采用BCA法检测各馏分总蛋白含量,结果与离子交换柱洗脱曲线一致。根据分析结果,选取四大洗脱峰中的代表性馏分,进一步追踪筛选其活性,并通过SDS-PAGE法定性鉴定对应馏分的蛋白分子量大小。结果显示相比眼镜蛇毒粗纯蛋白,各馏分对人肝癌HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50)较大。其中第一洗脱峰抗癌活性最强,它对应的是两类疏水性各异的蛋白混合物,在反相色谱平缓洗脱条件下仍然难以分开,蛋白分子量分布于<14-30KDa。本实验应用溶液酶解,2D-LC, QStar Elite MS/MS技术鉴定相应馏分的蛋白成分,结构鉴定、数据处理工作仍在进行当中。