论文部分内容阅读
本文从以下三部分进行了阐述：
第一部分 晚发型多种酰基辅酶A脱氢酶缺陷症临床特点分析
目的：
脂质沉积性肌病(Lipid storage myopathy，LSM)是骨骼肌组织病理上能检测出大量脂滴沉积于肌纤维内的一类代谢性肌病的总称。
MADD是一种较常见的脂质沉积性肌病，属于常染色体隐性遗传病，致病包括ETFA基因、ETFB基因和ETFDH基因。
分析了3例基因型相似的晚发型MADD患者的临床表现，指出该病具有临床异质性高的特点，极易被误诊为多发性肌炎、肝病、肠易激综合征等疾病，进一步提出可以通过肌肉磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）的特征性肌肉脂肪浸润分布，鉴别晚发型MADD与其他肌肉病。目前公认晚发型MADD治疗的一线用药是核黄素，但在缺乏基因诊断和骨骼肌组织活检的情况下，晚发型MADD在临床表现上极易与多发性肌炎混淆，而多发性肌炎的常规治疗方式是糖皮质激素冲击或口服。临床上许多晚发型MADD患者由于被误诊为多发性肌炎，而给予糖皮质激素治疗。尽管糖皮质激素对改善晚发型MADD患者的脂肪酸代谢可能有一定帮助，部分患者在激素治疗后临床症状轻度改善，但该药应用于晚发型MADD患者是否合理仍然缺少客观依据。因此，收集晚发型MADD患者的临床基线和随访资料，进行了一项核黄素和糖皮质激素疗效分析的历史队列研究，从临床表现、鉴别诊断和治疗三方面探讨了晚发型MADD的疾病特征。
方法：
1.分析3例基因型相似的晚发型MADD患者的临床特点和实验室检查结果。
2.收集28例经临床、骨骼肌组织病理、基因确诊的晚发型MADD患者临床资料及双下肢肌肉MRI影像资料，分析其肌肉病变影像学特点。
3.收集45例经临床表现、骨骼肌组织病理、基因确诊的晚发型MADD患者的基线及随访资料，患者根据用药史分为糖皮质激素组和核黄素组，两组患者分别服用两种药物一个月，运用Mann-Whitney U检验和Chi-square检验，比较用药前后两组患者颈部、四肢肌力及激酶的改善程度。
结果：
1.3例基因型相似的晚发型MADD患者临床表现存在较大差异。
2.28例晚发型MADD患者下肢肌肉MRI以股后群肌脂肪浸润和萎缩为特征，这一特点可与其他神经肌肉病相鉴别。
3.经过一个月的药物治疗，与糖皮质激素组相比，核黄素组患者的肌力明显升高（P＜0.05），但肌酸激酶（creatine kinase,CK）、谷草转氨酶（aspartate amino transferase,AST）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）治疗前后的差值在两组中无明显差异。
4.比较两组肌力、肌酶完全恢复正常的患者数，在近端肢体肌力和CK项目中，核黄素组的患者数明显高于激素组（P＜0.05）。
5.约有半数患者经过一个月核黄素治疗后仍表现为肌酶升高和肌力减弱。
结论：
1.晚发型MADD临床表现高度异质。
2.晚发型MADD患者下肢肌肉MRI以股后群肌脂肪浸润和萎缩为特征，这一特点可与其他神经肌肉病相鉴别。
3.糖皮质激素不能替代核黄素在治疗晚发型MADD的地位，且一个月的核黄素治疗不足以完全缓解患者的临床症状和实验室检查指标。
4.骨骼肌组织活检及致病基因测序有助于诊断晚发型MADD。
第二部分 晚发型多种酰基辅酶A脱氢酶缺陷症线粒体凋亡通路激活
目的：
晚发型MADD的主要致病基因是ETFDH基因，该基因编码的ETFDH蛋白定位于线粒体内膜，接受从脂肪酸β-氧化产生的电子，传递给ETF蛋白，电子最后进入线粒体氧化呼吸链，参与ATP产生和维持线粒体内膜两侧膜电位。ETFDH基因突变导致该蛋白表达量下降，ETFDH蛋白功能缺陷导致脂肪酸β-氧化功能障碍，最终引起大量脂质沉积于骨骼肌肌纤维内。
线粒体不仅是重要的产能单位，更参与调控细胞凋亡和代谢等病理生理过程。对于晚发型MADD患者，组织细胞是否存在线粒体介导的细胞组织凋亡仍无明确依据。因此，通过骨骼肌组织活检收集患者肌肉组织，进行凋亡相关蛋白免疫印迹分析（western blot,WB），并对骨骼肌冰冻组织切片进行脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL）原位染色，阐述ETFDH基因突变后的晚发型MADD患者骨骼肌组织线粒体凋亡途径激活。
ETFDH基因突变导致突变型ETFDH蛋白表达量减少，本课题组前期研究发现，造成这一现象的机制是突变体ETFDH蛋白通过泛素化途径被降解，其特异的泛素E3连接酶是CHIP。但是这一证据仍需要体内实验进一步证实，通过对晚发型MADD患者的骨骼肌组织进行免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP），完善体外实验的结论。
方法：
1.骨骼肌组织分离线粒体和其他细胞成分后抽提蛋白,进行蛋白质免疫印迹分析，比较线粒体内突变型ETFDH蛋白与对照组之间的差异。
2.原代培养晚发型MADD患者的骨骼肌成纤维细胞，对其进行放线菌酮（cycloheximide,CHX）干预，验证突变体ETFDH蛋白稳定性。
3.对晚发型MADD患者肌活检取材的新鲜骨骼肌组织，分离线粒体和其他细胞成分，利用western blot技术分析凋亡相关蛋白表达。
4.利用患者骨骼肌组织冰冻切片进行TUNEL染色，验证是否存在组织凋亡。
5.新鲜骨骼肌组织进行Co-IP，验证突变型ETFDH蛋白和泛素E3连接酶CHIP间的相互作用。
6.黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide,FAD）干预原代培养的患者及对照的骨骼肌成纤维细胞。
结果：
1.晚发型MADD患者骨骼肌组织线粒体内突变型ETFDH蛋白表达量明显低于对照组。
2.CHX干预后突变型ETFDH蛋白表达量随时间递减。
3.骨骼肌组织存在caspase-3蛋白的激活。
4.在细胞质成分中检测到从线粒体释放的细胞色素C（cytochrome C,cyt C）。
5.晚发型MADD患者骨骼肌组织切片原位TUNEL染色阳性。
6.组织Co-IP提示突变体ETFDH蛋白和泛素E3连接酶CHIP存在相互作用，热休克蛋白家族70（Hsp70）参与其中。
7.FAD干预使ETFDH蛋白表达量升高。
结论：
1.ETFDH突变导致蛋白稳定性下降，在体内水平验证这一过程是通过泛素E3连接酶CHIP介导的泛素化过程实现的，Hsp70参与这一过程。
2.晚发型MADD患者存在线粒体介导的凋亡过程。
3.FAD能部分地恢复ETFDH蛋白的表达。
第三部分 EtfdhA83T/A83T突变敲入小鼠模型构建及表型鉴定
目的：
发现在晚发型MADD患者中，ETFDH基因突变后骨骼肌存在线粒体凋亡途径，但突变对于线粒体代谢和氧化呼吸链功能的后续影响尚不清楚，希望通过构建动物模型，模拟晚发型MADD患者脂肪酸代谢异常等病理改变，从内源性水平检测线粒体介导的凋亡途径、细胞氧化应激以及机体代谢异常等线粒体功能改变。本课题组前期发现，在中国南方汉族人群晚发型MADD患者中，ETFDH-c.250G＞A(p.Ala84Thr)突变等位基因频率达83.3%，且以纯合突变为主。因此，构建了带有该突变热点的EtfdhA83T/A83T基因敲入C57BL/6J小鼠模型，并且对其分子生物学表型进行鉴定。
方法：
1.小鼠出生后10-14天剪鼠尾抽提DNA，聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)后鉴定基因型及纯化PCR产物测序。
2.取孕18.5天胎鼠大腿组织制作冰冻切片，进行苏木素-伊红染色（hematoxylin eosin,HE）及油红O染色（oil red O,ORO）。
3.孕18.5天胎鼠断头取血，制作干血滤纸片，进行血酰基肉碱谱分析。
4.孕18.5天胎鼠组织匀浆抽提蛋白，利用western blot检测ETFDH、ETFA及ETFB蛋白表达量。
结果：
1.鼠尾DNA PCR检测提示ETFDH-c.247G>A(p.Ala83Thr)被敲入。
2.ORO染色可见大量脂滴沉积于肌纤维。
3.血酰基肉碱谱提示纯合子小鼠多种酰基肉碱升高。
4.组织western blot分析提示纯合子鼠ETFDH蛋白表达量明显低于野生型和杂合子鼠。
结论：
本课题构建的ETFDH-c.247G＞A(p.Ala83Thr)突变敲入小鼠的分子生物学表型符合晚发型MADD患者ETFDH蛋白表达量降低、脂质沉积于肌纤维、血多种酰基肉碱升高的特征，有望成为研究晚发型MADD发病机制的模式生物。
第一部分 晚发型多种酰基辅酶A脱氢酶缺陷症临床特点分析
目的：
脂质沉积性肌病(Lipid storage myopathy，LSM)是骨骼肌组织病理上能检测出大量脂滴沉积于肌纤维内的一类代谢性肌病的总称。
MADD是一种较常见的脂质沉积性肌病，属于常染色体隐性遗传病，致病包括ETFA基因、ETFB基因和ETFDH基因。
分析了3例基因型相似的晚发型MADD患者的临床表现，指出该病具有临床异质性高的特点，极易被误诊为多发性肌炎、肝病、肠易激综合征等疾病，进一步提出可以通过肌肉磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）的特征性肌肉脂肪浸润分布，鉴别晚发型MADD与其他肌肉病。目前公认晚发型MADD治疗的一线用药是核黄素，但在缺乏基因诊断和骨骼肌组织活检的情况下，晚发型MADD在临床表现上极易与多发性肌炎混淆，而多发性肌炎的常规治疗方式是糖皮质激素冲击或口服。临床上许多晚发型MADD患者由于被误诊为多发性肌炎，而给予糖皮质激素治疗。尽管糖皮质激素对改善晚发型MADD患者的脂肪酸代谢可能有一定帮助，部分患者在激素治疗后临床症状轻度改善，但该药应用于晚发型MADD患者是否合理仍然缺少客观依据。因此，收集晚发型MADD患者的临床基线和随访资料，进行了一项核黄素和糖皮质激素疗效分析的历史队列研究，从临床表现、鉴别诊断和治疗三方面探讨了晚发型MADD的疾病特征。
方法：
1.分析3例基因型相似的晚发型MADD患者的临床特点和实验室检查结果。
2.收集28例经临床、骨骼肌组织病理、基因确诊的晚发型MADD患者临床资料及双下肢肌肉MRI影像资料，分析其肌肉病变影像学特点。
3.收集45例经临床表现、骨骼肌组织病理、基因确诊的晚发型MADD患者的基线及随访资料，患者根据用药史分为糖皮质激素组和核黄素组，两组患者分别服用两种药物一个月，运用Mann-Whitney U检验和Chi-square检验，比较用药前后两组患者颈部、四肢肌力及激酶的改善程度。
结果：
1.3例基因型相似的晚发型MADD患者临床表现存在较大差异。
2.28例晚发型MADD患者下肢肌肉MRI以股后群肌脂肪浸润和萎缩为特征，这一特点可与其他神经肌肉病相鉴别。
3.经过一个月的药物治疗，与糖皮质激素组相比，核黄素组患者的肌力明显升高（P＜0.05），但肌酸激酶（creatine kinase,CK）、谷草转氨酶（aspartate amino transferase,AST）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）治疗前后的差值在两组中无明显差异。
4.比较两组肌力、肌酶完全恢复正常的患者数，在近端肢体肌力和CK项目中，核黄素组的患者数明显高于激素组（P＜0.05）。
5.约有半数患者经过一个月核黄素治疗后仍表现为肌酶升高和肌力减弱。
结论：
1.晚发型MADD临床表现高度异质。
2.晚发型MADD患者下肢肌肉MRI以股后群肌脂肪浸润和萎缩为特征，这一特点可与其他神经肌肉病相鉴别。
3.糖皮质激素不能替代核黄素在治疗晚发型MADD的地位，且一个月的核黄素治疗不足以完全缓解患者的临床症状和实验室检查指标。
4.骨骼肌组织活检及致病基因测序有助于诊断晚发型MADD。
第二部分 晚发型多种酰基辅酶A脱氢酶缺陷症线粒体凋亡通路激活
目的：
晚发型MADD的主要致病基因是ETFDH基因，该基因编码的ETFDH蛋白定位于线粒体内膜，接受从脂肪酸β-氧化产生的电子，传递给ETF蛋白，电子最后进入线粒体氧化呼吸链，参与ATP产生和维持线粒体内膜两侧膜电位。ETFDH基因突变导致该蛋白表达量下降，ETFDH蛋白功能缺陷导致脂肪酸β-氧化功能障碍，最终引起大量脂质沉积于骨骼肌肌纤维内。
线粒体不仅是重要的产能单位，更参与调控细胞凋亡和代谢等病理生理过程。对于晚发型MADD患者，组织细胞是否存在线粒体介导的细胞组织凋亡仍无明确依据。因此，通过骨骼肌组织活检收集患者肌肉组织，进行凋亡相关蛋白免疫印迹分析（western blot,WB），并对骨骼肌冰冻组织切片进行脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL）原位染色，阐述ETFDH基因突变后的晚发型MADD患者骨骼肌组织线粒体凋亡途径激活。
ETFDH基因突变导致突变型ETFDH蛋白表达量减少，本课题组前期研究发现，造成这一现象的机制是突变体ETFDH蛋白通过泛素化途径被降解，其特异的泛素E3连接酶是CHIP。但是这一证据仍需要体内实验进一步证实，通过对晚发型MADD患者的骨骼肌组织进行免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP），完善体外实验的结论。
方法：
1.骨骼肌组织分离线粒体和其他细胞成分后抽提蛋白,进行蛋白质免疫印迹分析，比较线粒体内突变型ETFDH蛋白与对照组之间的差异。
2.原代培养晚发型MADD患者的骨骼肌成纤维细胞，对其进行放线菌酮（cycloheximide,CHX）干预，验证突变体ETFDH蛋白稳定性。
3.对晚发型MADD患者肌活检取材的新鲜骨骼肌组织，分离线粒体和其他细胞成分，利用western blot技术分析凋亡相关蛋白表达。
4.利用患者骨骼肌组织冰冻切片进行TUNEL染色，验证是否存在组织凋亡。
5.新鲜骨骼肌组织进行Co-IP，验证突变型ETFDH蛋白和泛素E3连接酶CHIP间的相互作用。
6.黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide,FAD）干预原代培养的患者及对照的骨骼肌成纤维细胞。
结果：
1.晚发型MADD患者骨骼肌组织线粒体内突变型ETFDH蛋白表达量明显低于对照组。
2.CHX干预后突变型ETFDH蛋白表达量随时间递减。
3.骨骼肌组织存在caspase-3蛋白的激活。
4.在细胞质成分中检测到从线粒体释放的细胞色素C（cytochrome C,cyt C）。
5.晚发型MADD患者骨骼肌组织切片原位TUNEL染色阳性。
6.组织Co-IP提示突变体ETFDH蛋白和泛素E3连接酶CHIP存在相互作用，热休克蛋白家族70（Hsp70）参与其中。
7.FAD干预使ETFDH蛋白表达量升高。
结论：
1.ETFDH突变导致蛋白稳定性下降，在体内水平验证这一过程是通过泛素E3连接酶CHIP介导的泛素化过程实现的，Hsp70参与这一过程。
2.晚发型MADD患者存在线粒体介导的凋亡过程。
3.FAD能部分地恢复ETFDH蛋白的表达。
第三部分 EtfdhA83T/A83T突变敲入小鼠模型构建及表型鉴定
目的：
发现在晚发型MADD患者中，ETFDH基因突变后骨骼肌存在线粒体凋亡途径，但突变对于线粒体代谢和氧化呼吸链功能的后续影响尚不清楚，希望通过构建动物模型，模拟晚发型MADD患者脂肪酸代谢异常等病理改变，从内源性水平检测线粒体介导的凋亡途径、细胞氧化应激以及机体代谢异常等线粒体功能改变。本课题组前期发现，在中国南方汉族人群晚发型MADD患者中，ETFDH-c.250G＞A(p.Ala84Thr)突变等位基因频率达83.3%，且以纯合突变为主。因此，构建了带有该突变热点的EtfdhA83T/A83T基因敲入C57BL/6J小鼠模型，并且对其分子生物学表型进行鉴定。
方法：
1.小鼠出生后10-14天剪鼠尾抽提DNA，聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)后鉴定基因型及纯化PCR产物测序。
2.取孕18.5天胎鼠大腿组织制作冰冻切片，进行苏木素-伊红染色（hematoxylin eosin,HE）及油红O染色（oil red O,ORO）。
3.孕18.5天胎鼠断头取血，制作干血滤纸片，进行血酰基肉碱谱分析。
4.孕18.5天胎鼠组织匀浆抽提蛋白，利用western blot检测ETFDH、ETFA及ETFB蛋白表达量。
结果：
1.鼠尾DNA PCR检测提示ETFDH-c.247G>A(p.Ala83Thr)被敲入。
2.ORO染色可见大量脂滴沉积于肌纤维。
3.血酰基肉碱谱提示纯合子小鼠多种酰基肉碱升高。
4.组织western blot分析提示纯合子鼠ETFDH蛋白表达量明显低于野生型和杂合子鼠。
结论：
本课题构建的ETFDH-c.247G＞A(p.Ala83Thr)突变敲入小鼠的分子生物学表型符合晚发型MADD患者ETFDH蛋白表达量降低、脂质沉积于肌纤维、血多种酰基肉碱升高的特征，有望成为研究晚发型MADD发病机制的模式生物。