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阿尔兹海默症(Alzheimer’disease)是中、老年人群中最常见的神经退行性疾病,病人脑内特征性的老年斑主要成分β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-peptide,Aβ)在发病过程中起着关键的作用。淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)作为Aβ的前体,其代谢调控对Aβ的产生十分重要。本实验室克隆到一种人APP基因的新剪接产物APP639(APP-AE2),相比脑内大量存在的APP695蛋白,APP-AE2缺少N端第二个外显子编码的56个氨基酸(E2区)。APP-△E2代谢为Aβ的前体羧基末端片段和生成Aβ的能力明显下降,培液中的分泌性产物也明显减少。这种代谢的下调,主要发生在α-、β-分泌酶作用的过程。亚细胞定位结果显示,APP-AE2与APP695在亚细胞定位上也存在较大的差异,不能够定位到分泌酶分布的细胞器上。将E2区内部的半胱氨酸(Cysteine,Cys)位点突变可以得到与APP-△E2类似的结果,而把包含E2在内的N端生长因子类似区域缺失并不会影响APP的代谢。E2区的缺失使得APP蛋白的N端结构被破坏,在细胞内主要以聚集的包涵体形式存在。进一步的研究发现,APP-△E2被高度的泛素化,并且E3泛素化酶CHIP通过其自身的泛素化活性促进了这一泛素化的过程。由此,我们推测APP蛋白N端空间结构的完整性对于APP蛋白的正常运输和代谢具有重要的作用,N端E2的缺失使得APP蛋白不能正常运输,在细胞内形成大量高度泛素化的包涵体,进而影响其代谢过程。
第二章 Smad6抑制Wnt/β-catenin信号通路的机制研究
在神经管中,BMP信号通路和Wnt/β-catenin信号通路对于神经前体细胞干性和细胞周期的维持都发挥着重要的作用。神经前体细胞要退出细胞周期进入分化状态,必须要同时抑制这两个信号通路。我们发现Smad6作为BMP信号通路的负调控因子,不仅可以抑制鸡胚神经管中的BMP信号,还可以抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性,促进神经前体细胞进入分化状态。并且Smad6对Wnt/β-catenin信号通路的抑制并不依赖于BMP信号通路的活性。报告基因活性实验显示,Smad6对Wnt/β-catenin信号通路的抑制发生在β-catenin或其下游的层次上。Smad6可以与β-catenin相互作用,但这种相互作用并没有影响β-catenin的降解过程和入核过程,也不影响β-catenin与TCF4形成转录复合物。C端缺失的Smad6不能抑制BMP信号通路但仍然能够抑制Wnt/β-catenin信号通路,提示Smad6的N端或Linker区参与了对Wnt/β-catenin信号通路的调控。Smad6的Linker区可以结合一种参与转录调控的Co-repressor,CtBP,Smad6可以与CtBP协同作用抑制Wnt/β-catenin信号通路。在鸡胚神经管中,CtBP的表达区域与Smad6有重叠,也证明了二者在功能上的相关性。免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀实验显示Smad6可以促进CtBP结合到TCF4/β-catenin转录复合物中,形成一个转录抑制复合物,抑制Wnt/β-catcnin信号通路,而Linker区突变的Smad6不具有这种功能。我们的结果提示,Smad6可以通过自身的不同区域分别调控BMP信号通路和Wnt/β-catenin信号通路。