掺锶微弧氧化钛表面促进2型糖尿病大鼠种植体骨结合的实验研究

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目的:  种植体与骨结合界面的情况与种植体的成功率密切相关。种植体材料的理化性能、种植床对种植体的反应以及手术操作都会影响种植体与骨组织的结合。钛种植体材料的表面特性直接影响细胞或细胞基质与植入体的相互作用,在很大程度上决定了最终骨结合的情况。改变种植体材料的表面特性,包括表面形貌、自由能、晶体结构和化学成分等,可以改变种植体的生物学活性,促进种植体骨结合。另一方面,种植体周围的骨髓基质干细胞(BMSCs)是形成种植体骨结合的主要细胞来源,BMSCs的增殖分化能力将影响种植体骨结合的状况。糖尿病会延缓和损伤四肢躯干骨和颅骨中的骨愈合和改建。有研究显示糖尿病患者种植体失败率于非糖尿病患者,而且早期失败率高。动物模型显示糖尿病影响骨结合。持续性的高血糖会同时抑制成骨细胞和破骨细胞活性,但对成骨细胞的影响大于对破骨细胞的影响,骨形成受抑制程度大于骨重吸收受抑程度,最终导致骨量流失。由糖尿病造成的各种骨代谢异常可能导致糖尿病患者种植体的失败率高于非糖尿病患者。因此在种植体表面添加可以改善BMSCs增殖分化能力的化学元素,并能持续释放到种植周围的细胞外基质中,将有望可以提高糖尿病患者骨髓基质干细胞的成骨分化能力,促进种植体周围新骨形成,改善糖尿病患者的种植体骨结合,降低糖尿病患者种植体的失败率。课题利用微弧氧化技术在钛合金(TC4)表面构建 Ti02膜,通过水热法在表面掺入锶离子,制备含锶微弧氧化钛种植体,研究对2型糖尿病大鼠种植体骨结合的影响。  材料和方法:  1.利用微弧氧化技术在钛合金(Ti6A14V)表面构建Ti02涂层,再利用水热法在涂层表面掺入锶离子。用过扫描电镜,X射线光电子能谱分析和X-射线能量分散分光计对材料进行表征,并对种植体释放的锶离子进行测定。  2.通过高糖高脂饮食结合低剂量腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)溶液诱导2型糖尿病大鼠模型,比较2型糖尿病大鼠与正常大鼠在体重,血糖,血清总胆固醇和血清胰岛素水平的差异,用三点弯曲实验测试大鼠股骨抗折性能的变化。  3.体外分离培养2型糖尿病大鼠骨髓基质干细胞,对细胞骨架染色后评价细胞在不同处理钛合金表面的附着情况,用MTT法检测细胞在不同处理钛合金表面的增殖情况,用PR-PCR,ALP活性测定,茜素红染色及半定量和蛋白免疫荧光染色,研究细胞在不同处理钛合金表面的成骨分化能力,同时研究材料浸提液对细胞增殖和成骨分化的影响。  4.在2型糖尿病大鼠双侧股骨分别植入MAO种植体和Ti-acid种植体,术后于第1周,第4周分别注射四环素溶液、钙黄绿素溶液和茜素红溶液标记种植体周围新骨形成,种植术后8周处死大鼠,制备含有种植体的股骨硬组织切片,用激光共聚焦显微镜观察种植体周围新骨形成速度,用苦味酸-品红染色观察种植体骨结合,用Micro-CT检测种植体周围骨量,推入试验评价种植体骨结合强度。  5.在2型糖尿病大鼠双侧股骨分别植入MA0和MAO+Sr种植体,术后于第1周,第4周分别注射四环素溶液、钙黄绿素溶液和茜素红溶液标记种植体周围新骨形成,种植术后8周处死大鼠,制备含有种植体的股骨硬组织切片,用激光共聚焦显微镜观察种植体周围新骨形成速度,用苦味酸-品红染色观察种植体骨结合,用Micro-CT检测种植体周围骨量,推入试验评价种植体骨结合强度。  结果:  1.对钛片进行微弧氧化处理后,在钛片表面形成含有微纳米结构孔隙的Ti02涂层,微弧氧化的钛片经过含有锶离子的电解液处理后,表面形貌无明显变化,元素分析结果显示样本表面含有一定量的锶元素。锶离子缓释测试显示锶离子浓度随时间变化而变化,前7天的锶离子浓度随时间缓慢递增,从第7天到第14天,锶离子浓度变化较大,14天以后锶离子的浓度基本保持在一个恒定的水平。  2.对SD大鼠予以高糖高脂饮食喂养可以引起大鼠体重,血糖,总胆固醇,血清胰岛素水平增加,糖耐量下降。给予腹腔低剂量注射STZ溶液,并继续予以高糖高脂饮食喂养,可以引起血糖进一步升高,大于16.7!1111101/1,血清胰岛素水平低于正常大鼠,模型接近人类2型糖尿病特征。三点弯曲实验测试显示2型糖尿病大鼠股骨弹性极限和断裂强度低于正常大鼠。  4.对钛合金表面进行微弧氧化处理后有利于2型糖尿病骨髓基质干细胞在材料表面的早期粘附,细胞伸展更加充分。对微弧氧化钛表面进行水热法掺锶处理后,细胞成骨分化相关基因和蛋白表达进一步上调,ALP活性增加,矿化结节沉积量增多,OCN蛋白免疫荧光染色增强。细胞在微弧氧化掺锶钛片浸提液中表现出ALP活性增强,ALP和OCN基因表达增强。  5. MAO种植体骨结合率大于Ti-acid种植体,骨再生速度略高于Ti-acid种植体,推入试验显示最大推入力大于Ti-acid种植体。  6. MAO+Sr种植体周围骨再生速度和骨结合率大于MAO种植体周围骨再生速度和骨结合率。Micro-CT显示种植体周围形成的骨体积和骨小梁数目多于MA0种植体,推入试验显示最大推入力大于MA0种植体。  结论:  2型糖尿病引起的代谢紊乱会降低骨髓基质干细胞成骨分化能力,影响骨形成和骨质,造成骨骼抗折性能下降。对钛合金表面微弧氧化处理并结合水热法掺锶处理后可以获得具有缓释锶离子的种植体表面,并可以改善2型糖尿病骨髓基质干细胞的成骨分化能力,促进种植体周围新生骨量和骨结合强度,有利于种植体骨结合。
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