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目的：
探讨VDN大鼠血管钙化的不同阶段基因谱表达的变化。
方法：
将24只SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠（体重220g～260g）随机分为对照组(Ctrl组)，血管钙化8周组(VC8w组)，血管钙化16周组(VC16w组)，每组8只。VC8w组和VC16w组大鼠制作VDN血管钙化模型：维生素D3300KU/kg肌肉注射1次，尼古丁25mg/kg溶于花生油灌胃，9h后重复灌胃1次。Ctrl组大鼠则予生理盐水肌注1次及单纯溶媒花生油间隔灌胃各1次。大鼠均普通饮食，相同条件饲养。VC8w组和Ctrl组大鼠于实验第8周处死，VC16w组大鼠继续饲养至16周处死。分离各组大鼠腹主动脉，分别用HE染色和VonKossa染色，观察血管钙化的组织学改变。原子吸收分光光度法测定各组大鼠血管组织钙含量。提取各组大鼠血管组织总RNA，逆转录成cDNA，进一步合成双链cDNA(dscDNA)。将dscDNA用限制性核酸内切酶RaslI切成短钝头末端，酶切后的目的dscDNA分成两等份，在T4连接酶作用下分别连上接头1R和接头2R，将连有不同接头的VC8w组和Ctrl组大鼠血管组织及VC16w组和VC8w组血管组织分别作正反双向抑制消减交杂，得到消减cDNA片段，即初步消减文库。在连接酶的作用下将差异表达cDNA片段与pMD-18T质粒载体连接成重组DNA分子，将重组载体导入感受态菌DH-5α以扩增文库。随机挑选克隆经菌落PCR鉴定为阳性克隆后送测序，将测序结果通过Blastn与国际公共数据库进行核酸序列同源性检索和对比，分析检索结果。挑选10个基因进行原组织RT-PCR验证和DNA条带半定量分析。
结果：
(1)组织病理检查示Ctrl组大鼠动脉组织血管内皮及中膜弹力层完整，无钙盐沉积；VC8w组大鼠动脉中膜变形扭曲，棕褐色钙盐在动脉中膜呈线样沉积，局部弹力板破坏；VC16w组大鼠较钙化组相比，仍见钙盐沉积，但是可见钙盐沉积较为稀疏，并在钙盐沉积处见吞噬细胞。
(2)组织钙测定示Ctrl组、VC8w组和VC16w组大鼠血管组织钙含量分别为(5.20±0.75)μg/mg、(15.34±2.51)μg/mg和(12.73±1.89)μg/mg。VC8w组大鼠血管组织钙含量较Ctrl组明显升高(P＜0.01);VC16w组大鼠血管组织钙含量较VC8w组低（P＜0.05）。
(3)经2套抑制消减杂交后获得4个差异表达基因的cDNA文库，分别为：VC8w组较Ctrl组高表达基因cDNA文库(VC8w-Ctrl)、VC8w组较Ctrl组低表达基因cDNA文库(Ctrl-VC8w)、VC16w组较VC8w组高表达基因cDNA文库(VC16w-VC8w)和VC16w组较VC8w组低表达基因cDNA文库(VC8w-VC16w)。经过菌落PCR筛选，4个消减文库获得623个阳性克隆，克隆片段的长度在150～400bp左右。挑选216个阳性克隆成功测序。文库(VC8w-Ctrl)经同源性检索和比对最终确定43个差异表达基因片段与已知全长基因具有高相似性，这些基因包括Bmp4、spock1、Cdh13、Tnfaip3等，检索基因功能主要涉及骨化，其次有氧化、凋亡等；文库(Ctrl-VC8w)经同源性检索和比对最终确定差异表达基因片段11个，这些基因包括Atp1b1、Gimap等，下调基因功能主要与编码ATP酶、GTP酶等有关；文库(VC16w-VC8w)经同源性检索和比对最终确定差异表达基因片段31个，包括Enpp1、Ggps1、Prps2、Ank2、Abcc1等，基因功能主要与焦磷酸合成、谷氨酸信号相关，其次还有部分与氧化还原和凋亡调节有关；文库(VC8w-VC16w)经比对后最终确定差异表达基因片段22个，包括Bmp15、Alpl、Colla2、Lox12，下调基因功能主要涉及骨化及氧化功能等。
(4)对挑选的10个差异基因在原组织中进行验证，RT-PCR及DNA条带灰度值分析提示Prdx3、Ank2、Ror2、Abcc1、CytoP450、Nell1等10个基因均在原组织中差异表达变化，表达相差平均1.7倍以上，而管家基因GAPDH在两组中的表达无明显差异。
结论：
1、VDN模型诱导的大鼠血管钙化可以自发性消退。
2、在钙化形成早期，许多钙化促进基因表达上调；而钙化消退早期，许多钙化抑制基因上调，同时伴部分钙化促进基因表达下调。
3、钙化抑制基因的表达增加伴钙化促进基因的表达下调可能是血管钙化发生自发性消退的基因学基础。