【摘 要】
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副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌病的病原菌。作为危害猪呼吸道的重要病原菌之一,每年都会为全球养殖业带来巨大损失,该病的防控一直是个难题。而艾纳香,作为一种传统苗药,虽未见用其于猪病的报道,无论从中药理论上分析或是考虑到其本身良好的体外抗菌能力和体内安全性,都具有治疗副猪嗜血杆菌病的潜力。本课题即对艾纳香油抗副猪嗜血杆菌的体内外效果进行了研究,并对其抗菌机制进行了初步的探索。实验从艾纳香油对副猪嗜血杆菌的
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副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌病的病原菌。作为危害猪呼吸道的重要病原菌之一,每年都会为全球养殖业带来巨大损失,该病的防控一直是个难题。而艾纳香,作为一种传统苗药,虽未见用其于猪病的报道,无论从中药理论上分析或是考虑到其本身良好的体外抗菌能力和体内安全性,都具有治疗副猪嗜血杆菌病的潜力。本课题即对艾纳香油抗副猪嗜血杆菌的体内外效果进行了研究,并对其抗菌机制进行了初步的探索。实验从艾纳香油对副猪嗜血杆菌的体外抑菌作用入手,评价了其对副猪嗜血杆菌的体外抗菌特性,再根据得到的实验结果,应用i TRAQ-LC-MS/MS高通量蛋白质组学与生物信息学对经过艾纳香油作用后产生差异性表达的蛋白质进行分析,对其抗菌作用分子机制进行了初步的探索,并对艾纳香油在豚鼠副猪嗜血杆菌病模型中的体内预防作用进行验证。主要结果如下:1.艾纳香油对副猪嗜血杆菌的体外抑制效果与机制初探参考微量肉汤稀释法测定MIC和MBC,根据MIC和MBC,使用不同浓度的艾纳香油作用于副猪嗜血杆菌36h并测定各时间段的OD600,得到细菌生长曲线;然后使用透射电子显微镜观察艾纳香油对副猪嗜血杆菌形态学的影响;并使用SDS-PAGE分析艾纳香油对副猪嗜血杆菌总蛋白质表达量的影响。然后通过i TRAQ-LC-MS/MS技术,结合Uniprot＿Haemophilus＿parasuis数据库对艾纳香油MIC浓度处理后的副猪嗜血杆菌进行肽段的提取与蛋白质定性和定量,筛选出差异表达显著的蛋白,进行聚类分析,并进一步使用GO和KEGG工具对差异蛋白的功能和富集通路进行分析。结果显示:（1）艾纳香油对副猪嗜血杆菌的MIC和MBC分别为0.625μg/mL、1.25μg/mL。（2）艾纳香油能够抑制副猪嗜血杆菌的生长曲线。（3）浓度为MIC的艾纳香油即可严重破坏副猪嗜血杆菌细胞结构。（4）艾纳香油能剂量依赖性抑制副猪嗜血杆菌总蛋白质表达。（5）艾纳香油处理后的副猪嗜血杆菌差异表达蛋白主要出现在了8个细胞组成（CC）,16个生物学过程（BP）和7个分子功能（MF）。（6）富集程度显著的KEGG通路一共有7个,包括Nitrogen metabolism、ABC transporters、Nicotinate and nicotinamide metabolism等。总结:艾纳香油对副猪嗜血杆菌的体外抑菌效果极佳,可能主要通过其对副猪嗜血杆菌细胞膜结构的破坏,Nitrogen metabolism通路的抑制达成对副猪嗜血杆菌的生长曲线与总蛋白质表达的有效抑制。2.艾纳香油对副猪嗜血杆菌急性毒性感染豚鼠模型的体内抗菌作用将30只雄性豚鼠随机分为5组,即对照组、模型组,以及低、中、高剂量给药组。每日对给药组豚鼠经口灌服艾纳香油微囊,其余组别灌服等量灭菌生理盐水。第三天给药2h后,向实验组与模型组豚鼠腹腔注射4×109CFU副猪嗜血杆菌,记录了攻毒后12h内各组豚鼠的死亡情况与体温变化情况,并对各组豚鼠脏器进行了拍照记录,脏器指数测定;选取肺脏、肝脏制作了病理切片;对各组豚鼠进行了血常规计数,使用相应的ELISA试剂盒测定了血清中的相关炎性因子表达情况,包括IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ。结果显示:（1）攻毒后12h内,模型组死亡率为33.3%,低剂量组16.7%,其余豚鼠均存活。（2）模型组豚鼠体温在攻毒后1h以内就开始下降,均值远低于一开始的正常体温值。而给药组体温相对接近正常值。（3）解剖学变化除肺组织外,并无明显差异。对于肺组织,肉眼可见模型组有严重淤血的情况,随着给药剂量的增加出现好转。（4）仅各组的肺脏系数出现了显著性差异（p<0.05）,并且模型组的肺系数最高。（5）模型组豚鼠血液中的白细胞含量与中性粒细胞含量和比例均较高,与除了低剂量给药组以外的组别相比具有显著性差异（p<0.05）。单核细胞计数各组间并未出现明显差异。（6）与模型组相比,给药组的IL-1、IFN-γ、TNF-α、NO、IL-8平均水平均呈药物依赖性降低。但是攻毒的各组IL-8表达水平并未见显著差异,且均显著高于对照组。总结:艾纳香油微囊经口灌服后也能对急性感染副猪嗜血杆菌的豚鼠起到良好的保护作用。能够降低豚鼠死亡率,减轻全身炎症反应。
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