【摘 要】
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成纤维细胞生长因子-8a(fibroblast growth factor-8a, FGF8a)是成纤维细胞生长因子家族(fibroblast growth factor family, FGFs家族)的第8个成员FGF8的a亚型,不仅是胚胎发
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成纤维细胞生长因子-8a(fibroblast growth factor-8a, FGF8a)是成纤维细胞生长因子家族(fibroblast growth factor family, FGFs家族)的第8个成员FGF8的a亚型,不仅是胚胎发育阶段必需的细胞调节因子,更有多种生物学功能,能够高效安全地促进组织损伤的修复,还在神经干细胞培养过程中起重要的营养和诱导作用,因此具有广阔的临床应用前景。重组人FGF8a(recombinant human fibroblast growth factor-8a,rhFGF8a)是将人FGF8a基因经过体外改造克隆后以生物工程菌表达得到的多肽,具有与天然FGF8a相同的活性。同时,与从天然动物组织中提取的FGF8a相比,更具有产量高、成本低,资源丰富等优点。本研究采用前期已经构建成功的FGF8a-pET28a-Rosetta作为表达菌株,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)诱导、菌体破碎后发现,在可溶和不可溶的胞质组分当中,均有rhFGF8a的存在。但通过尝试多种纯化方式发现,以可溶形式表达的目的蛋白难以纯化,而以包涵体形式表达的rhFGF8a只需经过一次镍柱亲和层析便可以获得纯度高达95%以上的目的蛋白。本文还通过平行对比实验,对rhFGF8a的复性条件进行优化。实验结果证明,FGF8a稀释到50μg/ml,在pH值为8.0,添加了氧化/还原型谷胱苷肽的复性缓冲液里的复性效果最好。将纯化后的蛋白用MTT法进行细胞活性检测,结果显示,FGF8a对成纤维细胞具有一定的促增长作用。ED50约为50ng/ml。rhFGF8a的等电点为10.5,是一种强碱性蛋白,不利于纯化。按一般经验,蛋白质在带负电荷时复性效果较好,但对于等电点高达10.5的rhFGF8a而言,这是不可行的。本研究通过对各种条件的摸索,在蛋白带正电荷的情况下,成功地获得了纯度达95%以上并具有一定生物活性的rhFGF8a蛋白。这对其它强碱性蛋白的纯化起到了一定的参考作用。
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