【摘 要】
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骨质疏松症是一种以低骨量为特征,并导致骨折风险增加的骨组织微体系结构退化的疾病。近十年来,大量的全基因组关联分析(GWASs)、meta分析等表明wnt16基因上的单核苷酸多态性
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骨质疏松症是一种以低骨量为特征,并导致骨折风险增加的骨组织微体系结构退化的疾病。近十年来,大量的全基因组关联分析(GWASs)、meta分析等表明wnt16基因上的单核苷酸多态性(SNP)位点突变与BMD相关,在小鼠敲除模型中也有证实。但wnt16在体内调节骨骼发育的分子机制尚不清楚,尤其是在胚胎发育早期。本研究采用分子遗传学手段,利用CRISPR基因编辑技术在斑马鱼中敲除wnt16基因,为研究wnt16对斑马鱼骨骼发育的影响、揭示wnt16调节骨骼发育的分子机制奠定基础。通过建立wnt16敲除斑马鱼模型,对于骨质疏松症药物的开发与筛选也具有重要意义。为了提高打靶效率,本研究同时注射两个靶位点gRNA到0-1个细胞水平的斑马鱼胚胎。受精后50h检测发现此次注射具有有效性。F0代斑马鱼成鱼经剪尾提取基因组进行T7E1酶切分析和基因型分析鉴定了4种突变型斑马鱼。将这些F0代突变型斑马鱼分别与野生型杂交获得F1代胚胎,在F1代成鱼中共筛选到5种不同突变型斑马鱼。TA克隆及测序结果显示wnt16(21)F1和wnt16(7)F1这两种突变品系的斑马鱼没有产生移码,只改变部分氨基酸序列,用Phyre预测其蛋白质空间结构,发现其二级结构中的一个α螺旋结构发生改变。将同种基因型的雄性和雌性斑马鱼杂交得到F2代胚胎,在wnt16(21)F2中已鉴定到纯合突变的雌鱼。对wnt16(21)F2和wnt16(14)F2用阿尔辛蓝进行软骨染色,发现wnt16(21)F2中存在Meckel’s cartilage变长、脊柱弯曲的斑马鱼,这说明wnt16基因对斑马鱼的骨骼发育有影响。
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