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前言 庆大霉素内耳毒性作用包括对前庭和耳蜗两部分毒性，尤其对前庭损害更严重，其损伤内耳前庭毛细胞的具体作用机制还不十分清楚，相关研究已从细胞凋亡角度探索前庭毛细胞损伤机制，并证实庆大霉素损伤后的前庭毛细胞中可以观察到核固缩、染色质凝集、凋亡小体形成等细胞凋亡的显著特征；同时，丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）中的JNK信号途径也被发现在凋亡细胞的信号传导途径起着重要作用。本实验试通过前庭毛细胞铺片、DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡、免疫组化方法检测磷酸化的JNK（p-jnk），研究庆大霉素造成内耳前庭毛细胞的损伤特点及作用机制。 材料与方法 1．1 实验动物 耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠30只，体重250～300克，雌雄兼用。随机分成二组，每组15只；实验组庆大霉素100mg·kg-1·d-1，腹腔注射，连续7天；对照组：生理盐水等量腹腔注射，连续7天。动物实验期间每天测体重以调整药量，第8天处死豚鼠。左耳做毛细胞铺片，右耳做取听泡作连续冰冻切片，行免疫荧光及免疫组织化学检测。 1．2 毛细胞铺片标本制备 各组豚鼠麻醉状态下，快速断头处死，取左侧听泡，开放卵圆窗和圆窗，从半规管开窗灌注新鲜配制的0.5％硝酸银溶液2～3ml，用4％多聚甲醛溶液灌注并固定于该溶液中，自然光下曝光2～3小时，解剖显微镜下剥离，取半规管壶腹嵴光镜下观察，摄片。 1．3 冰冻切片标本制备 取实验组和对照组右侧听泡，4％多聚甲醛溶液固定24小时，10％甲酸-甲酸钠脱钙一周（25℃）。30％蔗糖4℃过夜，行OCT包埋，恒冷箱切片机沿蜗轴平行方向行10μm厚连续切片并编号，单号码切片行TUNEL法染色，双号码切片行免疫组织化学染色，观察壶腹晴毛细胞。1 .4荧光显色检测凋亡TuNEL试剂盒、DAPI由Promeg。公司提供。冰冻切片干燥，4%多聚甲醛固定45分钟，0.2%Tritonx一100浸泡5分钟，加入T叮酶反应液于37’C反应60分钟，DAPI复染。封片，荧光显微镜下观察。采用DNasel降解的标本作为阳性对照，PBS代替TdT酶反应液的标本作为阴性对照。1.5免疫组织化学检测p一jnk抗体由cell singnal提供。ABc试剂盒，DAB显色剂由武汉博士德公司提供。冰冻切片干燥，过氧化物酶阻断，室温孵育10分钟，滴加正常山羊血清，室温孵育20分钟，滴加一抗（兔抗鼠p一jnk多克隆抗体），4’C过夜。滴加二抗（生物素化羊抗兔工gG），室温孵育20分钟，滴加链霉素亲和素过氧化物酶溶液，37’C反应20分钟，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察，摄片。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤不变。结果 毛细胞铺片显示:实验组中可以看到毛细胞肿胀，结构混乱，排列不整齐;对照组中毛细胞排列规整，细胞间隔均匀，边界清楚，基本正常。 荧光显色显示:实验组毛细胞核排列紊乱，发现了TuNEL染色阳性的、波长为520nlll的绿色荧光着色的细胞，位于壶腹晴顶端近上皮腔面的细胞层，从分布特点来看为前庭毛细胞，这也是被认为对庆大霉素药物毒性最敏感的部位，支持细胞层未发现TuNEL标记的阳性细胞;对照组中毛细胞核排列整齐，未见绿色荧光激发。 免疫组织化学染色结果:实验组铺片显示有棕黄色颗粒沉淀在壶腹晴顶端，提示存在磷酸化的JNK免疫活性毛细胞，在底部、细胞排列较整齐的区域则没有观察到磷酸化的JNK免疫活性细胞;同样，免疫标记在对照组及阴性对照组中均呈阴性反应。 荧光染色与免疫组化染色结果比较:在荧光染色阳性的对应切片标本组中，免疫组化染色显示有棕黄色颗粒沉淀。两组不同染色组切片相比较，染色阳性细胞位置基本一致，且均位于壶腹晴顶端，从分布特点来看为前庭毛细胞;荧光染色阴性的对应切片组中，则未见免疫染色阳性细胞。 结论 1.全身大剂量应用庆大霉素可以诱导内耳前庭毛细胞凋亡、损伤前庭毛细胞 2.磷酸化的JNK在前庭毛细胞凋亡中起到了重要作用