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原发性肝癌是严重危害人类生命健康的重大疾病之一,其恶性程度高,发展迅速,容易复发。化疗是目前治疗肿瘤的三大手段之一,但原发性肝癌化疗的疗效并不理想,主要原因在于肝癌对化疗不敏感,其机制还不清楚。目前多使用肝动脉化疗栓塞(TACE)进行局部化疗,并已经成为目前不能切除肝癌治疗的首选。肝癌是一种高代谢的肿瘤,耗氧量高于正常组织,并且肿瘤内血管结构和功能的异常可致肿瘤细胞血供和氧供减少,故肝癌组织处于低氧环境。而TACE栓塞了肿瘤动脉血供,会进一步加重肝癌的缺血缺氧。低氧导致肿瘤细胞内基因转录活性发生改变,启动一系列应激反应,使肿瘤细胞逃逸凋亡。肝癌细胞对化疗药物作用的抵抗,正是由于化疗药物不能有效地诱导肝癌细胞的凋亡,部分肝癌细胞存活下来成为残留肿瘤细胞。而残存的细胞大都为低氧细胞,成为复发和(或)转移的根源。故肿瘤细胞对化疗的抗拒性增加是其逃逸凋亡的表现。低氧可导致肿瘤细胞对化疗药物的抵抗,但具体机制目前尚不明确。研究证实低氧可以诱发细胞自噬。自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程,生命体借此维持蛋白代谢平衡及细胞内环境的稳定。自噬作为一种防御机制,在细胞饥饿、生长因子缺乏特别是缺氧条件下对维持细胞的存活、免于凋亡有积极作用。所以,低氧环境中肝癌细胞的凋亡逃逸乃至对化疗药物的抵抗极有可能由自噬介导。为证实这一猜想,本课题从以下三个方面进行研究:第一部分研究低氧对肝癌细胞化疗敏感性的影响;第二部分研究低氧诱发细胞自噬在肝癌细胞化疗抗性中的作用,从而在细胞水平探讨低氧介导肝癌细胞化疗抗性的作用机制;第三部分研究低氧、自噬和细胞凋亡相关分子之间的关系,从分子水平探讨低氧诱发自噬介导肝癌细胞化疗不敏感的作用机制。第一部分低氧环境对肝癌细胞化疗敏感性的影响首先应用不同剂量的化疗药物:cisplatin、epirubicin、mitomycin和gemcitabine,处理肝癌细胞SMMC-7721不同时间,观察不同化疗药物对肝癌细胞存活的影响以及这些化疗药物的细胞毒性和剂量、时间之间的依赖关系;其次根据以上实验结果在1%O2的低氧条件下选用合适的药物作用浓度和药物作用时间,处理肝癌细胞:SMMC-7721和HepG2,观察在1%O2的低氧和20%O2的常氧条件下,化疗药物造成的细胞毒性之间的差异。结果提示,在一定的药物作用浓度下,化疗药物处理肝癌细胞一定时间后,在低氧培养环境中造成的细胞死亡率明显低于常氧,低氧环境中的肝癌细胞表现出明显的化疗抗性,而且这种化疗抗性普遍存在于各种化疗药物处理的肝癌细胞中,而不是某种化疗药物特异的,结果提示低氧环境中肝癌细胞对化疗药物的抵抗作用可能存在普遍性。第二部分低氧诱导的自噬在肝癌细胞化疗抗性中的作用本部分实验拟从细胞水平探讨低氧是通过哪种机制介导肝癌细胞的化疗抗性的。化疗药物主要通过诱导细胞凋亡发挥其抗肿瘤作用。而低氧容易引起细胞周期阻滞。那么,低氧是否是通过影响肝癌细胞的凋亡来影响化疗药物的作用效果?本研究中低氧介导的肝癌细胞化疗抗性是否与细胞周期阻滞相关呢?于是,我们分别在1%O2和20%O2中培养肝癌细胞SMMC-7721,同时化疗药物处理,通过DAPI染色从形态学上观察细胞凋亡的改变,通过PI-AnnexinV染色流式细胞仪定量检测细胞凋亡,PI染色检测细胞凋亡和细胞的周期分布情况,从而探讨低氧介导的肝癌细胞化疗抵抗与细胞凋亡、细胞周期分布之间的关系。形态学和流式细胞仪对细胞凋亡的定量分析结果均显示,与常氧条件下化疗药物诱导的细胞凋亡相比,低氧条件下化疗药物处理后肝癌细胞的凋亡率明显降低;而且两组细胞的细胞周期分布情况相似,无显著性差异,提示本研究中肝癌细胞的化疗抗性与细胞周期阻滞之间无明显相关性;由此可见低氧条件下肝癌细胞的化疗抗性是由于细胞凋亡能力的降低,而这并不是由细胞周期阻滞介导的。那么,是什么机制使低氧环境中细胞的凋亡能力降低呢?有研究显示,自噬可以增强细胞在不利环境中的生存能力,于是我们向肝癌细胞SMMC-7721和HepG2中转染可以表达自噬标志性分子LC3的质粒——GFP-LC3,然后分别置1%和20%O2中培养,将前部分研究结果显示的低氧环境中肝癌细胞化疗抗性最明显的cisplati(n20μM)处理组作为研究对象,荧光显微镜下观察GFP-LC3的表达间接检测自噬的发生情况;为了进一步明确自噬是否参与了低氧环境中肝癌细胞的化疗抵抗,我们还应用自噬抑制剂3-MA作用于肝癌细胞,然后检测自噬被抑制前后细胞凋亡的改变,从而探讨自噬在低氧介导的肝癌细胞化疗抗性中的作用。荧光显微镜下观察发现,低氧培养后的肝癌细胞中可以看到大量点状绿色荧光分布,而常氧培养的肝癌细胞中很少或几乎看不到,证明自噬不能被常氧所诱导,诱导明显的自噬的发生。而且自噬抑制剂——3-MA可以有效地抑制肝癌细胞的自噬,因为即使是在低氧环境中,3-MA处理后肝癌细胞中只有少量的点状绿色荧光。对3-MA处理前后细胞凋亡的分析显示,低氧环境中细胞的自噬被抑制后,化疗药物诱导的肝癌细胞凋亡明显增加,与常氧条件下化疗药物诱导的细胞凋亡率相当,提示可能是自噬促进了肝癌细胞在低氧环境中的生存,抑制了细胞凋亡,从而介导低氧条件下肝癌细胞对化疗药物的抵抗。第三部分低氧诱导自噬增强肝癌细胞化疗抗性相关分子的检测在本部分实验中,我们首先应用Western Blotting检测常氧与低氧条件下HIF-1α蛋白的表达,发现1%O2可以诱导HIF-1α蛋白表达的上调,而20%O2环境中几乎检测不到HIF-1α的表达;其次,构建HIF-1α特异的siRNA并转染肝癌细胞SMMC-7721,然后分别应用Western Blotting和Realtime-PCR检测HIF-1α和自噬相关基因Atg5的表达,发现HIF-1α被抑制后Atg5mRNA的表达明显降低;同时荧光显微镜下观察LC3Ⅱ的表达发现,HIF-1α被抑制后LC3Ⅱ的表达明显减少;结果提示,HIF-1α可能参与了低氧诱导的自噬的调控;最后通过检测低氧和常氧以及siRNA-HIF-1α作用前后caspase3的表达,从分子水平探讨低氧对细胞凋亡的影响。结果显示,与常氧条件下化疗药物作用后caspase3的表达量相比,低氧环境中caspase3的表达量明显降低,但是低氧条件下HIF-1α的表达被抑制后,caspase3的表达量上调,而且与常氧化疗后caspase3的表达量相当。这些结果初步阐明了低氧介导的肝癌细胞化疗抵抗的分子作用途径,提示低氧可能是通过上调HIF-1α的表达激活HIF-1,HIF-1发挥其转录因子的作用促进自噬相关分子Atg的表达,然后再直接或间接地抑制凋亡关键分子caspases的表达,从而抑制细胞凋亡,介导肝癌细胞对化疗药物的抵抗。这为自噬参与低氧介导的肝癌细胞化疗抗性分子机制的深入研究奠定了基础,为针对肝癌组织中处于低氧微环境肿瘤细胞的治疗新方法的探索提供了实验依据。综上所述,我们的研究结果提示如下结论:1.低氧可在一定程度增强肝癌细胞的化疗抗性,该研究结果提示肿瘤生长及TACE治疗造成的局部低氧环境可能影响化疗效果。2.低氧可以诱导肝癌细胞发生自噬,而正是自噬介导了低氧条件下肝癌细胞对化疗药物的抵抗,低氧诱导的自噬被抑制后,肝癌细胞的化疗抗性即被逆转。其作用机制是由于低氧条件下,自噬的发生促进了细胞在不利环境中的生存,从而对抗化疗药物诱导的细胞凋亡。3.低氧诱导自噬增强肝癌细胞化疗抗性的过程,在分子水平可能是低氧通过上调HIF-1α的表达激活HIF-1,HIF-1发挥其转录活性促进自噬相关分子Atg的表达,然后直接或间接地抑制凋亡关键分子caspases,从而抑制细胞凋亡,介导肝癌细胞对化疗药物的抵抗。