论文部分内容阅读
哺乳动物精卵融合是一个精卵表面众多分子参与的复杂过程。基因敲除实验证明位于精子表面的具有二硫键的免疫球蛋白超家族成员IZUMO1是精卵融合的必须因子。体外抑制剂和抗体抑制实验表明蛋白二硫键异构酶(Proteindisulfide-isomerase,PDI)家族的部分成员也能影响精卵融合,其中PDIA3最为重要。但目前尚不知道IZUMO1和PDIA3影响精卵融合的分子机制。本实验拟克隆绒山羊和绵羊Pdia3 cDNA,结合本实验室已经克隆的绒山羊和绵羊Izumol基因,探索PDIA3能否与IZUMO1结合,共同参与精卵融合。
实验首先从绵羊和绒山羊睾丸组织中提取总RNA,根据牛Pdia3 cDNA序列设计引物,用RT-PCR方法分别成功克隆了绵羊和绒山羊的Pdia3 cDNA。克隆得到的绵羊Pdia3 cDNA序列为1660 bp,绒山羊的Pdia3序列为1591bp,两者的编码区(CDS)均为1518 bp,编码505个氨基酸,两者的核酸和氨基酸序列完全相同,与牛、人、大鼠和小鼠的相似性分别是99.21％、95.05％、89.50％和90.89％。将GenBank和Ensembl数据库中公布的31种动物的PDIA3的完整氨基酸序列与我们克隆的绵羊和绒山羊PDIA3氨基酸序列进行了比对分析,结果发现PDIA3在不同种动物中的同源性很高,部分基序(包括CGHC)在所有物种中绝对保守。将克隆得到的绵羊Pdia3 CDS全长序列与表达载体pGEX-4T-1连接构建表达载体pGEX-Pdia3,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG成功诱导表达出GST-PDIA3融合蛋白,经亲和层析和切胶纯化后得到较高纯度的GST-PDIA3融合蛋白,以此作为免疫原免疫昆明(KM)小鼠。四次加强免疫后向小鼠腹腔注射S180细胞,成功地制备出小鼠抗绵羊GST-PDIA3腹水多克隆抗体,经Western blot检测,所制备的腹水多克隆抗体能够特异性地识别PDIA3蛋白和GST蛋白。我们用戊二醛交联法对抗体进行了纯化,去除了其中识别GST的抗体,纯化后的抗体仍然能够识别PDIA3蛋白。
用纯化后的腹水多克隆抗体和绵羊睾丸组织石蜡切片进行免疫组织化学检测,结果显示在绵羊睾丸组织中PDIA3普遍存在于从精母细胞到次级精母细胞的细胞质中,并且在leydig细胞中也表达。精子免疫组织化学检测发现PDIA3位于绒山羊精子的赤道区。RNA原位杂交结果显示Pdia3基因在精原细胞、初级精母细胞以及次级精母细胞中转录。
本实验还将真核表达载体BiFC-VC155-PDIA3和BiFC-VN173-IZUMO1共转染人Hela细胞,收集细胞总蛋白,用免疫共沉淀和Western blot首次证明PDIA3与IZUMO1在细胞中能相互结合。