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目的肺炎支原体(MP)是儿童和青少年呼吸道感染常见的病原体,由于儿童处于生长发育期,治疗儿童MP感染的药物首选大环内酯类。目前许多学者均认为大环内酯类抗生素的疗程不可少于2-3周,这仅来自于我们临床医生的经验,尚缺少病原学方面的依据。直接检出病原体为诊断的金标准,但分离培养法条件要求严格,耗时长,阳性率低等缺点被限制应用于临床。本文对肺炎支原体肺炎(MPP)患儿,于不同病程时相分别采集咽试子,采用巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,扩增具有种属特异性的16SrRNA基因,检测咽试子标本中的MP-DNA,记录MP-DNA消失时间,拟依据MP-DNA消失时间结合临床表现,作为病原学方面的参考及结合临床表现,指导临床大环内酯类抗生素的疗程。材料和方法一、研究对象1、实验组2008年11月～2009年8月于我院儿科呼吸病房住院的肺炎患儿。根据入选标准和剔除标准入选的患儿共100例：男57例,女53例；年龄3月-14岁(平均年龄5.3岁)；普通型组40例,重型组60例(依据赵顺英重型MPP诊断标准)；高抗体组58例,低抗体组42例(MP-Ab≥1：1280高抗体,≤1：640为低抗体)2、正常对照组同期我院儿童保健门诊取无呼吸道感染的20例健康儿童咽拭子作为对照组,男12例,女8例,年龄3岁-10岁(平均年龄5岁),年龄及性别构成比与实验组无统计学差异。二、标本采集用无菌生理盐水浸湿的无菌咽拭子适度用力擦拭患儿咽后壁,标记明确后于-80℃低温保存备用,同时抽血1ml低温保存,用于微量颗粒凝集法(PA)检测MP抗体(MP-Ab)。每间隔1周用同样方法采集患儿咽试子复查MP-DNA及MP-Ab,直至MP-DNA阴性,停止复查。三、主要仪器和试剂PCR仪、高速低温离心机、电泳仪、超净工作台、震荡仪、干浴锅；taq DNA聚合酶、dNTP,引物,MP-DNA裂解液.四、方法1、Nested-PCR扩增(1)DNA提取(2)以16SrRNA为靶基因,设计2套引物,进行nested PCR扩增。(3)电泳观察结果(4)统计分析2、PA法检测MP-Ab,按说明书操作,检测结果为MP总抗体(IgG及IgM)滴度。实验结果1、扩增16SrRNA基因检测MP-DNA与常规PA法检测MP-Ab比较,二者阳性率一致,Nested PCR法检出阳性结果早于PA法。2、20例健康对照组Nested PCR法扩增16SrRNA基因检测MP-DNA均为阴性。3、Nested PCR法扩增16SrRNA基因动态检测100例MPP患儿,MP-DNA消失时间的中位数为5周,95%的MPP患儿体内MP-DNA消失时间大于3周。100例MPP患儿有78例(占78%)MP-DNA消失时间在发病后3-6周。4、普通型MPP患儿MP-DNA存在时间的中位数是发病后4周,重型组MP-DNA存在时间的中位数是发病后6周。重型MPP的患儿MP-DNA存在时间长于普通型,统计学分析组间差异。5、重型MPP患儿予丙种球蛋白(IVIG)400-500 mg/Kg/d,连用3天,应用IVIG6、治疗组MP-DNA消失时间的中位数是5周,未用组MP-DNA消失时间的中位数是6周,经统计学分析,组间差异有统计学意义。7、MP-Ab高低与MP-DNA消失时间平均周数经统计学分析,组间无差异,但MP-DNA消失时间≥7周患儿中以高MP抗体者为主(16/20), MP-DNA消失时间≤4周和≥7周两组经统计学分析,差异有统计学意义,高MP抗体组MP-DNA存在时间更长。8、年龄性别与体内MP-DNA消失时间无相关。结论1、Nested-PCR法扩增16SrRNA检测MP-DNA,灵敏度与常规Mp-Ab检测相同,特异性高于常规Mp-Ab检测,不受感染时间的限制,可作为早期确诊MP感染的病原学依据,且有助于既往MP感染的诊断。2、MP-DNA消失时间大部分在3周-6周。重型MPP患儿MP-DNA存在时间大于普通型MPP。依据MP-DNA消失时间及临床表现,考虑普通型MPP临床大环内酯类抗生素的疗程3-4周,重型MPP疗程4-6周。3、在重型MPP急性期予IVIG治疗,可能会缩短MP-DNA的存在时间,有助于MPP的治疗。4、MP-DNA消失时间较长患儿中以高MP抗体者为主,提示我们血清MP抗体滴度较高时结合临床表现,可能需适当延长大环内酯类抗生素的疗程。5、年龄性别与MP-DNA的存在时间无相关,不同年龄性别不影响大环内酯类抗生素的疗程。