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溢出代谢即在有氧条件下代替呼吸作用并伴随着能量减少的一种代谢过程。它是菌株对于不同生长条件下生物能量和物质合成过程中蛋白质组分的需求改变做出的一种全局的生理反应。在过去的几十年里人们对溢出代谢进行了广泛的研究，发现其通常发生在底物过剩的情况下并在代谢过程中产生大量的副产物。目前典型的溢出代谢有以葡萄糖为碳源的大肠杆菌有氧代谢中乙酸的溢出，酿酒酵母中乙醇的溢出等。通过对这些溢出代谢机制解析，能够定量的分析代谢过程中可观察的变化以及准确的预测在新扰动下产生的响应。所以溢出机制的解析与应用对发酵过程调控、代谢流分析等研究方面具有重大意义。 课题组在研究利用大肠杆菌AFP111合成琥珀酸过程中，为了提高细胞的利用效率，建立了细胞的重复批次发酵的工艺，当一次厌氧发酵结束时，在氮限制的条件下，有氧诱导3～5h后回收菌体细胞进行下一批次的厌氧发酵合成琥珀酸。研究过程中发现:在氮限制条件下进行有氧诱导，因培养基中无葡萄糖存在，琥珀酸、乙酸被细胞作为碳源消耗。进一步延长诱导时间至40 h发酵液中可检测到＞35 g/L苹果酸和约10g/L富马酸，即苹果酸溢出现象。因此，得到了一种新的三阶段合成苹果酸的方法。我们通过对有氧转化过程中的pH、温度以及发酵过程中的碳氮比等参数进一步进行优化，最终得到生产苹果酸的最优方法即在氮源限制以及发酵条件为35℃，pH6.8的情况下丁二酸、乙酸才会有效转化为苹果酸且有机酸转化率最高达到78％左右。 进一步对苹果酸溢出现象产生的原因进行探究，考察了细胞内的氧化还原情况以及基因的转录水平与该现象的关系。分别检测了有氧转化阶段细胞内的辅因子水平即NADH，NAD+，NAD(H)，NADH/NAD+的量以及呼吸链相关基因（ndh、nuoA、cyoA、cydB、atpA）的转录水平。发现在氮限制的条件下苹果酸溢出时细胞内的NAD+不足且氧化还原水平不平衡。其主要原因是在氮限制的条件下编码NADH脱氢酶的基因ndh转录水平受到抑制，导致呼吸能力受到限制，从而NAD+供给不足。总之，在氮限制的条件下呼吸能力受到限制，上升的胞内辅因子比例以及较低的能量供给都是苹果酸溢出的重要因素。 为了验证呼吸链受损是否是形成苹果酸溢出现象的关键原因，基于RED重组系统与Xer重组系统，对呼吸链中的ndh基因进行敲除，使得呼吸链中NADH脱氢酶失活，从而NADH无法转化为NAD+，呼吸链受到阻断，从而考察了改造菌株的溢出能力。结果表明敲除ndh的菌株并不能造成大量苹果酸溢出，但是代谢途径中中间产物（富马酸和苹果酸）积累的总量有明显的增加。进一步验证了呼吸链相关酶活性的下降发生代谢溢出现象的重要影响因素。对于不同呼吸链基因的改造，会改变菌株的代谢流分布。所以在未来的研究中，只需进一步对呼吸链基因进行精细调控，从而对代谢途径中中间产物的溢出形成规律性结论。这对代谢流的研究以及其他产品的生产方法的改进具有重大的意义。