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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。在PRRSV的全基因组中,Nsp2基因和ORF5基因变异最大,对这两个基因变异的分析在一定程度上能够反映PRRSV整个基因组变异的情况。本研究即通过对广东省不同PRRSV毒株Nsp2基因和ORF5基因的测定和比较,分析广东省流行毒株的遗传变异,进而了解广东省PRRSV流行毒株的分子流行病学规律,为PRRS的防制提供必要的分子流行病学基础。
采用RT-PCR方法扩增PRRSV的Nsp2基因和ORF5基因,得到13份PRRSV Nsp2基因的部分序列片段和14份PRRSV ORF5基因片段,并进行了序列测定和分析,发现13个Nsp2基因序列的长度均为457bp,均有两个区域存在明显缺失;14个ORF5基因序列长度均为603bp,不存在缺失现象。
序列分析表明所获得的13个Nsp2基因核苷酸同源性为96.9~99.1%,与CH-1a、VR-2332、MLV、LV的核苷酸同源性分别为83.6~86.4%、67.2~69.4%,、66.8~68.9%、21.9~23.2%;14个ORF5基因核苷酸同源性为98.8~99.7%,与CH-1a、VR-2332、MLV、LV的核苷酸同源性分别为94.4~95.2%、86.7~87.9%、86.4~87.6%、54.1~55.7%。ORF7基因14个序列之间核苷酸同源性为98.7~99.7%,与CH-1a、VR-2332、MLV、LV的核苷酸序列同源性分别为94.9~96.2%、93~94.6%、93~94.6%、58.1~58.6%,表明所获得的毒株均属于美洲型。参考国内外已经发表的Nsp2基因和ORF5基因序列,采用分子生物学软件DNAStar绘制了PRRSV的遗传发育演化关系图。根据ORF5基因序列遗传演化分析结果表明美洲型PRRSV可分为4个亚群,我国目前流行的PRRSV毒株属于其中的3个亚群:以BJ-4为代表的毒株属于亚群Ⅰ;以CH-1a,HB-1和HB-2株为代表的毒株属于亚群Ⅱ;以BJ-13为代表的毒株属于亚群Ⅳ。
对广东省部分规模化猪场疑似PRRS感染猪的病料或血清进行PRRSV的分离,从中分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)野毒株,并进行了初步鉴定。结果表明分离株能在Marc-145细胞上增殖并产生相应的细胞病变,用针对PRRSV GP7的引物对细胞培养物进行RT-PCR扩增,检测结果阳性,将分离株命名为PRRSVGD株。本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)GD株的E蛋白基因,克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV vector中,构建了腺病毒重组表达载体,经过抗性筛选、PCR扩增、单酶切等方法对其进行了鉴定,确定得到了含有目的基因的阳性克隆,成功构建了腺病毒表达载体pAd-E。本研究为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础。