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我国的野生泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)群体中不仅有二倍体,在长江流域,还分布有大量的天然四倍体。四倍体泥鳅的体型明显大于二倍体,具有显著的生长优势。然而,多倍体泥鳅快速生长的分子机理目前并不清楚。已有的研究发现,鱼类的生长受遗传和环境等多种因素的共同影响,其中,生长轴(GH/IGF-1轴)及其所分泌的激素在鱼类的生长过程中发挥着重要的调控作用。鱼类的GH/IGF-1轴主要由生长激素(GH),生长激素受体(GHR)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)等构成。多倍化是自然界中普遍存在的一种生物学现象,也是推动生物进化和物种形成的重要驱动力。生物体多倍化的过程中往往伴随着广泛的DNA甲基化等表观遗传修饰变异,而DNA甲基化和基因表达之间存在密切的相关性。本研究以二、四倍体泥鳅为材料,研究GH/IGF-1轴基因在二、四倍体泥鳅间的表达差异,分析其与泥鳅倍性间生长差异的相关性;比较二、四倍体泥鳅GH/IGF-1轴相关基因启动子区甲基化差异,探讨启动子区甲基化差异对基因表达的调控作用。主要研究结果如下:1.GH/IGF-1轴基因的c DNA序列克隆及分析1)二、四倍体泥鳅GH基因的c DNA序列长均为690bp,包括633bp的开放性阅读框(ORF)和57bp的5’UTR序列。ORF编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽以及188个氨基酸的成熟肽。二、四倍体泥鳅GH基因之间有7bp的核苷酸差异,但氨基酸序列完全相同。2)二、四倍体泥鳅GHR的c DNA序列长均为1913bp,包括1818bp的ORF和95bp的5’UTR序列。ORF编码605个氨基酸。二、四倍体泥鳅GHR基因之间有5bp核苷酸差异,氨基酸序列则完全相同。3)二、四倍体泥鳅IGF-1基因的c DNA序列为695bp,其中ORF为483bp,5’UTR和3’UTR分别为165bp和47bp。ORF编码160个氨基酸,包括44个氨基酸的信号肽和116个氨基酸的结构域(B、C、A、D和E)。二、四倍体泥鳅IGF-1基因之间只有1 bp的差异,氨基酸序列也完全相同。2.GH/IGF-1轴基因在二、四倍体泥鳅间的表达差异1)在二、四倍体泥鳅中,GH基因均只在垂体中特异性表达,在其它组织如肝脏、心脏和肌肉中均未检测到表达。倍性间比较结果显示,GH基因在四倍体泥鳅垂体中的表达水平显著高于二倍体(P<0.05)。2)在二、四倍体泥鳅中,GHR基因在各个组织中均有表达,但组织间的表达量存在差异,其中,肝脏中的表达量最高。倍性间比较结果显示,GHR基因在四倍体泥鳅肝脏中的表达水平也显著高于二倍体(P<0.05)。3)与GHR相同,IGF-1基因在二、四倍体泥鳅的各个组织中也均有表达,并且在肝脏中的表达量最高,四倍体泥鳅IGF-1基因在肝脏中的表达量也显著高于二倍体(P<0.05)。3.GH/IGF-1轴基因5’侧翼序列克隆及其特征分析1)采用TAIL技术,克隆得到泥鳅GH基因5’侧翼序列共1147bp,包括1081bp的启动子区和56bp的5’UTR区。泥鳅的GH基因的启动子序列具有TATA-box,但不具有CAAT-box,GC-box和E-box。启动子区包含1个垂体特异性转录因子Pit-1,以及多个AP-1、GATA1、GATA5、SRY、STAT4、STAT5a、YY1、Gfi1b等转录因子结合位点。二、四倍体泥鳅GH基因启动子序列的相似性达98.5%。与四倍体泥鳅相比,二倍体泥鳅中缺少1个C/EBP-β转录因子结合位点。2)克隆得到GHR基因5’侧翼序列1528bp,包括1345bp的启动子区和95bp的5’UTR区。泥鳅的GHR启动子具有真核生物启动子的典型保守结构特征,转录起始位点附近预测到TATA-box、CCAAT-box、GC-box和E-box。启动子区包含多个SP1、C/EBP结合位点、GH下游信号分子STAT5结合位点,以及肝脏特异表达相关的转录因子结合位点(C/EBP、HNF-5)等。3)克隆得到IGF-1基因1988bp,包括1778bp的启动子区和162bp的5’UTR区。泥鳅的IGF-1基因不具备典型的启动子结构特征,在其转录起始位点附近没有预测到TATA-box,CAAT-box和GC-box等序列。但在启动子区预测到多个C/EBP、Myo D、Sp1等转录因子结合位点。二、四倍体泥鳅IGF-1基因启动子序列相似性为97.4%。与二倍体相比,四倍体泥鳅的缺失部分片段,其中包含1个NFIX和1个C/EBP转录因子结合位点。4.泥鳅GH/IGF-1轴基因启动子区甲基化分析采用BSP技术比较了二、四倍体泥鳅GH/IGF-1轴基因启动子区的甲基化水平。结果显示,二倍体泥鳅GH、GHR和IGF-1基因启动子区的甲基化水平分别为88.9%、1.0%和0%;而四倍体甲基化水平分别为90.7%、0和7.4%。本研究结果显示,四倍体泥鳅GH/IGF-1轴基因的表达量均高于二倍体,而其启动子区的DNA甲基化水平与之相比,没有明显的相关性,该结果有待进一步探讨。