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脑损伤导致神经元死亡的两个主要机制是：氨基酸兴奋性毒性（amino acid excitotoxicity）和自由基损伤（free radical damage）。脑缺氧或其他损伤时，大量谷氨酸释放，Ca2+内流，细胞内Ca2+上升，最终导致细胞的损伤。离子型谷氨酸受体包括NMDA受体和非NMDA受体，后者又可分为AMPA受体和KA受体；其中NMDA受体在脑损伤中的作用受到关注。ROS（reactive oxygen species）包括超氧阴离子（superoxide anion），羟自由基（hydroxyl radical），过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）等。ROS的毒性作用包括脂质过氧化物（lipid peroxidation）的形成，线粒体呼吸链酶的抑制，膜Na+-K+-ATPase的抑制，以及其它蛋白的氧化修饰作用。其中H2O2通过Fenton reaction与铁、铜等金属离子发生反应，产生羟自由基（hydroxyl radicals，OH）产生毒性作用。 本实验室已经建立了离体脑片缺血模型，为了在脑片水平更深入研究脑损伤的机制。首先，必须完善制备海马脑片的方法，制备能够维持海马长时间活性的浴槽，以及建立海马脑片的细胞外电生理等方法。本研究建立海马脑片制备、浴槽设计以及细胞外电生理等方法；在此基础上，建立海马脑片缺血模型和观察药物治疗作用的方法；最后初步探讨了H2O2对海马脑片损伤作用的机制以及自由基损伤与兴奋性毒性之间的关系。通过本研究，希望能够为今后更深入研究海马脑片生理、药理特点打下坚实的基础，另外能够阐明H2O2致脑损伤的特点，为今后开发抗脑损伤药打下必要的基础。 1、海马脑片研究方法学的建立浙江大学硕士学位论文 大鼠断头取脑切片，所有的过程均在冰冷的状况下操作。用巴斯德管和沾有脑脊液的毛笔转移海马脑片，避免外界物质直接接触造成海马损伤。将制备好的海马脑片转移至气－液交界式浴槽。气－液交界式浴槽包括内室和外室。内室主要为嵌入体，用于放置海马脑片。外室主要作用是用预热的水蒸汽湿化脑片，并提供足够的氧气。本实验设计的浴槽有两个显著的特点：一方面是气－液交界的方式，可以保证脑片有充分的氧气供应。另一方面，脑片周围充分的液体交换，可以保证代谢产物的排泄。通过减少嵌入体上的尼龙网与底部的距离代替减少内室的直径，缩小内室的体积，最终加快了脑片周围的液体交换速度。另外用流入口和流出口分别位于其直径的1／3处来代替设置在两边，也可以加快脑片周围的液体交换速度。利用电生理、生化、形态方面来验证浴槽的可行性。细胞外电生理结果表明，稳定sh和lh的海马脑片相比较，海马脑片的 CA区锥体细胞记录到的群峰电位没有显著差异。TTC染色结果表明，在稳定lh与8 h之问保持平稳，OD。。。值分别为0二44 士 0刀2和0二35 上 0刀3，两者之间没有显著的差异。电镜检查结果表明，经稳定sh后的脑片锥体细胞，细胞核呈圆型或椭圆型：核与胞浆比例较大：核内常染色质呈颗粒状均质分布，异染色质量少；突触结构清晰：与稳定lh后的脑片锥体细胞核以及突触比较没有显著的差异。甲苯胺蓝染色结果表明，经稳定吕卜后的脑片锥体细胞有规则地紧密排列，细胞大而明显，膜完整而光滑，胞体呈椭圆型，细胞中央有一个大而圆的细胞核，核异染质量少；与稳定lh后的脑片锥体细胞比较没有显著的差异。这些结果证明本装置可以至少sh内保持海马脑片的活性。 2、缺氧缺糖诱导大鼠海马脑片电生理改变以及药物作用 利用我们设计的浴槽与细胞外电生理方法，来观察缺氧缺糖（oxygen and glucosedeprivation，OGD）对海马脑片群峰电位的影响。OGD 4 min，恢复供氧和葡萄糖 lh后 PS波幅上升至 OGD前的（29．4士 6．2）％，OGD 7 min，恢复 lh后 PS波幅上升至 OGD前的（17．2士 6．l）％；缺氧缺糖 10 min，恢复 lh后 PS波幅没有回升。因此，选择 4 min OGD损伤模型来观察药物的作用。 氯胺酮 10和 100 mpol／L明显地提高 PS波幅的恢复程度，分别达到（82．8士 11．8）％和（69二士 10）％。依达拉奉1和10pmol／L明显增强PS波的恢复程度，分别达到（56土门．l）％和（69．1 士 12．2）％；但 0．l卜mol／L没有显示效果。ONO－10781 apol／L没有影响OGD脑片损伤，其恢复程度为（33．89土 9．8）％，与对照组（29．4士 6．2）o没有显著差异；米诺环素 10卜mol／L也没有明显影响，其恢复程度为（24．3士 3．l）％，与对照组无显 2浙江大学硕士学位论文著差异。这些结果表明，电生理检测可以评价海马脑片缺血性损伤以及药物作用，并发现NMDA受体桔抗剂氯胺酮及自由基清除剂依达拉奉有保护作用，而抗炎药米诺环素和白三烯受体桔抗剂ONO－1078无效。 3、脑片HZOZ损伤的初步探讨 利用细胞外电生理法和脑片透光法，初步探讨H。OZ在脑片损伤中的作用。结果发现，HZO。对 PS波的影响呈浓度依赖关系。给予 H。O。4 mmol几处理脑片 15 min，15 min后引起 PS波幅轻微的降低，至给药前的 （7．8士 门．2）％；