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目的:探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染通过原癌基因c-JUN引起DKK1表达上调,以及DKK1在胃癌细胞生长和侵袭中的作用及分子机制。方法:(1)用c-JUN shRNA转染胃癌细胞AGS和SGC-7901 48h,加入H.pylori 1004感染细胞6h,收集细胞,提取总蛋白,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测各组c-JUN和DKK1蛋白的表达水平。(2)用过表达c-JUN质粒转染胃癌细胞株NCI-N87和SNU-16 48h,收集细胞,提取总RNA和总蛋白,分别用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)、WB分别检测各组c-JUN和DKK1 mRNA和蛋白的表达水平。(3)双荧光素酶实验:(1)获取DKK1启动子序列,构建含DKK1启动子序列的双荧光素酶表达载体(DKK1 P)并鉴定。(2)将过表达FOSL1质粒、过表达c-JUN质粒及DKK1 P分别或同时共转染AGS细胞,转染48h后裂解细胞,检测萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase,Rluc),计算萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光比值(Fluc/Rluc)。(4)筛选沉默/过表达DKK1稳定转染细胞,提取稳定转染细胞总RNA和总蛋白,RT-qPCR和WB分别检测DKK1 mRNA和蛋白表达水平。实验分为空白对照组(Control)、阴性对照组(shNC/NC)、沉默/过表达DKK1组,CCK8实验检测各组细胞培养0、24、48、72、96、120、144h后的生长情况,结晶紫染色计数细胞培养2周后克隆形成数目,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,流式细胞仪检测沉默DKK1基因后细胞周期和细胞凋亡。(5)筛选PI3K抑制剂LY294002最适浓度,处理过表达DKK1稳定转染AGS、BGC823细胞,分为DKK1过表达组、DKK1过表达+0.5%二甲基亚砜组(DKK1+0.5%DMSO)、DKK1过表达+LY294002组(DKK1+LY294002),CCK8实验检测各组细胞培养0、24、48、72、96、120、144h后的生长情况,结晶紫染色计数细胞培养2周后克隆形成数目,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力。(6)构建沉默/过表达DKK1的稳定转染细胞株,RT-qPCR检测PI3K、AKT和mTOR mRNA表达,WB检测PI3K、AKT、mTOR及其磷酸化蛋白的表达,并在沉默实验中用H.pylori 1004感染进行回复(Rescue)实验。(7)裸鼠成瘤实验:将过表达DKK1的稳定转染BGC823细胞,以3.5×10~6个/只接种于裸鼠(鼠龄3-4周)皮下。连续观察18天处死裸鼠,摘取瘤体,记录瘤体的重量及大小;固定瘤体进行织化学染色检测DKK1和Ki67表达;HE染色鉴定。结果:(1)c-JUN沉默实验结果显示:与阴性对照组比较,c-JUN基因干扰组中DKK1蛋白的表达降低,加入H.pylori1004后,DKK1蛋白的表达水平得到回复,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)c-JUN过表达结果显示:与阴性对照组比较,c-JUN过表达组中DKK1 mRNA和蛋白表达上调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(3)DKK1 P构建成功后,双荧光素酶实验结果显示:FOSL1、c-JUN能与DKK1启动子结合,促进荧光素酶基因的表达,且c-JUN与FOLS1有协同作用,增强荧光素酶基因的表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)成功构建沉默/过表达DKK1稳定转染细胞株后,结果显示:与shNC组比较,沉默细胞中DKK1基因,细胞生长、增殖、迁移和侵袭被抑制,细胞凋亡增加,细胞阻滞在G2/M期,差异均有统计学意义(P<0.05);与NC组比较,过表达DKK1能促进细胞生长、增殖、迁移和侵袭,差异均有统计学意义(P<0.05)。(5)用PI3K信号通路抑制剂LY2940002以50μmol/L 48h处理过表达DKK1的细胞,结果显示:与DKK1+0.5%DMSO组比较,细胞生长、克隆形成数及迁移、侵袭细胞数均显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。(6)沉默DKK1基因后PI3K信号通路相关蛋白表达下调,加入H.pylori 1004感染,表达量均得到回复,差异均有统计学意义(P<0.05)。过表达DKK1基因后PI3K信号通路相关蛋白表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。(7)裸鼠体内成瘤实验结果发现:与对照组(NC)比较,过表达DKK1组细胞移植瘤的体积和重量增加,并伴有肿瘤出血坏死;肿瘤组织中DKK1和Ki67表达增强。结论:(1)幽门螺杆菌感染通过上调c-JUN促进DKK1表达。(2)c-JUN单独或与FOSL1结合形成AP-1促进DKK1启动子的活性,c-JUN与FOSL1共同作用最强。(3)DKK1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控胃癌细胞恶性生物学表型。