论文部分内容阅读
结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的慢性传染病，目前仍是危害全球公共卫生与健康的主要疾病之一。据WHO公布的《2009年结核病控制报告》显示，2007年TB的新增病例约达927万，流行病例达到1370万，约有132万死亡病例（仅指非感染HIV的TB病例）和46万HIV（human immunodeficiency virus）-阳性的TB死亡病例。近年来，随着人口流动的增加、多重耐药菌株（mult-drug resistance，MDR-TB）的出现、Mtb与HIV病毒伴发感染的发生以及卡介苗（Bacillus Calmette Guerin，BCG）接种防护的自身局限性，结核病的发生率在全球呈上升趋势。
当前唯一可用的疫苗是BCG，其免疫保护效果存在显著差异（保护率0％～80％）。BCG在降低儿童原发性结核、结核性脑膜炎、粟粒性肺结核的发生方面发挥了重要作用，但对成人结核病预防作用则较小，且艾滋病（Acquired ImmuneDeficiency Syndrome，AIDS）病人接种BCG后可引起全身播散性感染。鉴于BCG的不足，研制新型疫苗以及对已研制的疫苗制定新的免疫策略增强抗结核效应就迫在眉睫。
我们实验室在前期的研究中，构建了结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合基因与IL-21共表达的DNA疫苗，通过肌肉注射的途径免疫实验动物，显示了一定的免疫效应。由于Mtb的主要传播途径为呼吸道，鼻粘膜免疫在有效控制结核感染方面显得尤为重要。鼻腔生理环境温和，抗原诱导免疫反应的阈值较低，加上鼻腔内含有丰富的血管，而且鼻腔免疫操作方便、创伤小等有利条件，因此，在前期实验基础上，我们采用鼻粘膜免疫的途径来观察其对实验动物的免疫及保护效果。本实验分为三部分：
一、鉴定结核杆菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗靶抗原的表达
目的：鉴定结核杆菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗靶抗原在小鼠黑色素瘤（B16F10）细胞中的表达。
方法：采用脂质体转染的方法，将结核杆菌Ag85A-ESAT-6与IL-21共表达DNA疫苗转染B16F10细胞，通过G418压力筛选出稳定转染的单细胞克隆。将该克隆扩增，采用RT-PCR的方法鉴定靶抗原IL-21的表达；采用Western blot方法鉴定其中靶抗原Ag85A、ESAT-6的表达。
结果：通过转染及RT-PCR、Western blot鉴定，结核杆菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗能稳定表达目的基因IL-21、Ag85A、ESAT-6。
结论：成功鉴定了结核杆菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗靶抗原表达，为下一步研究其对实验动物的免疫效应奠定了基础。
二、结核杆菌Ag85A-ESAT-6与IL-21DNA疫苗鼻粘膜免疫效应研究
目的：探讨结核杆菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗，鼻粘膜免疫诱导C57BI/6小鼠免疫应答效应，寻求合适免疫途径诱发小鼠产生更强的免疫应答。
方法：实验分为生理盐水对照组、空质粒组、Ag85A-ESAT-6组和Ag85A-ESAT-6-IL-21组，采用鼻粘膜免疫C57BL/6小鼠的方法，100μg不同疫苗/只，每次间隔一周，共免疫三次。通过NK细胞和脾细胞杀伤活性、脾淋巴细胞增殖实验，以及小鼠血清抗体、IFN-γ和IL-4水平的检测，评价鼻粘膜免疫诱导C57BI/6小鼠免疫应答效果。
结果：结核杆菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗组，与对照组相比，在NK细胞杀伤活性、脾细胞杀伤活性、脾淋巴细胞增殖方面显示出较好的免疫效应。同时，免疫鼠的血清中抗体水平、IFN-γ和IL-4水平也有明显上升，差异有显著性意义。
结论：结核杆菌Ag85A-ESAT-6与Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗能够诱导C57BL/6小鼠产生有效的免疫应答，为进一步在动物体内进行保护性实验提供了依据。
三、结核杆菌Ag85A-ESAT-6与IL-21共表达DNA疫苗初免-BCG鼻粘膜加强免疫及其保护效应研究
目的：采用结核杆菌Ag85A-ESAT-6与Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗初免-BCG加强（Prime-Boost）策略，研究鼻粘膜免疫对C57BL/6小鼠的免疫效果及对结核杆菌的保护效应，为结核DNA疫苗采用新的免疫方法提供新的思路。
方法：实验分为BCG皮下对照组、空质粒组、Ag85A-ESAT-6组、Ag85A-ESAT-6-IL-21组和BCG粘膜免疫组。采用鼻粘膜免疫C57BL/6小鼠的方法，100μg不同疫苗/只，每次间隔一周，不同DNA疫苗初免两次，再用BCG加强免疫一次，共免疫三次； BCG皮下组和BCG粘膜组三次均采用BCG进行免疫。末次免疫两周后，每只鼠用200μl1×106CFU结核杆菌H37Rv菌液通过尾静脉注射，进行攻击实验，评价不同疫苗对结核杆菌的保护效果。
结果：与单独BCG皮下组相比，DNA疫苗初免-BCG加强组的NK细胞杀伤活性、脾细胞杀伤活性、脾淋巴细胞增殖有一定增强；脾细胞上清与攻击前后血清中IFN-γ的分泌水平明显上升；同时支气管肺泡灌洗液（BAL）中的分泌性IgA（sIgA）的量在攻击前后显示一定的变化：BCG皮下组>Ag85A-ESAT-6-IL-21组>BCG粘膜组。攻击后，Ag85A-ESAT-6-IL-21组与BCG粘膜组肺组织载菌量与BCG皮下组相比，有所减少。
结论：结核杆菌Ag85A-ESAT-6及IL-21共表达DNA疫苗在采用Prime-Boost策略后，对实验鼠能产生较好的免疫效果及保护效应。