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目的:
1.研究细胞凋亡和肺缺血/再灌注损伤(LIRI)的关系；
2.探讨缺血后处理(IPO)防治LIRI的作用及对肺细胞凋亡及其相关基因的影响。
方法:
1.雄性SD大鼠32只(体重220～250g),随机分成随机分成4组(n=8),即对照组(C组)、肺缺血/再灌注组(I/R组)、肺缺血/再灌注+缺血预处理组(IPC组)、肺缺血/再灌注+缺血后处理组(IPO组)。麻醉后左侧开胸,游离肺门,穿过阻断带,复制在体原位单肺缺血/再灌注模型。C组左肺门过阻断带后不阻断肺门,观察2.5h；I/R组左肺门过阻断带后阻断肺门缺血0.5 h,松开阻断带再灌注2 h；IPC组于缺血前给予连续的缺血5min/再灌注5min预处理循环3次,其余处理同I/R组；IPO组在再灌注前给予连续的缺血30sec/再灌注30sec后处理循环3次,余同I/R组。
2.实验结束颈动脉取血检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、髓过氧化物酶(MPO)活性；取肺组织测湿/干重比(W/D)；采用原位末端标记法(TUNEL)检测肺组织凋亡指数(AI)；免疫组织化学、RT-PCR法测定肺组织Bcl-2、Bax蛋白及mRNA的表达；光镜、电镜观察肺组织形态学结构变化,并测定肺损伤组织学定量评价指标(IQA)。
结果:
1.与C组比较,I/R组血清SOD活性显著降低；MDA含量、MPO活力显著升高(P均<0.01),IPC组、IPO组与I/R组相比,MDA含量、MPO活力显著降低,SOD活性升高(P<0.05或P<0.01),IPC组与IPO组比较三者均无明显差异(P均>0.05)。
2.与C组比较,I/R组肺组织W/D、IQA值显著升高(P均<0.01),IPC组、IPO组与I/R组相比,肺组织W/D、IQA值显著降低(P均<0.01),IPC组与IPO组相比,W/D、IQA值无明显差异(P均>0.05)。
3.肺组织原位细胞凋亡检测示I/R组凋亡指数显著高于C组,IPC组、IPO组AI显著低于I/R组(P均<0.01),IPC组与IPO组相比无明显差异(P>0.05)。凋亡细胞主要为肺泡上皮细胞与血管内皮细胞。
4.免疫组化检测各组肺组织Bcl-2、Bax蛋白表达,在C组表达不明显,I/R组表达较C组明显上调,同时Bcl-2/Bax的比值降低(P均<0.01)；与I/R组比较,IPC组、IPO组Bcl-2蛋白表达增强,Bax表达减弱,Bcl-2/Bax的比值增高(P<0.05或P<0.01),IPC组与IPO组相比无明显差异(P>0.05)。阳性细胞主要分布于血管内皮细胞、肺泡上皮细胞及支气管上皮细胞。
5.RT-PCR检测肺组织Bcl-2、Bax mRNA显示:在C组表达不明显,I/R组表达较C组明显上调,同时Bcl-2/Bax的比值降低(P均<0.01)；与I/R组比较,IPC组、IPO组Bcl-2 mRNA表达增强,Bax mRNA表达减弱,Bcl-2/Bax的比值增高(P均<0.01),IPC组与IPO组相比无明显差异(P>0.051。
6.光镜检查:C组肺间质及肺泡结构保持完整,无明显受损,未见明显炎性细胞；I/R组可见肺间质增宽水肿,炎症细胞浸润,肺泡内可见较多红细胞渗出,损伤明显；IPC组与I/R组比较,可见肺间质水肿减轻,毛细血管轻度扩张、充血,肺泡内红细胞渗出减少,炎症细胞浸润减少；IPO组肺间质水肿程度减轻,炎症细胞浸润减少,肺泡内红细胞渗出减少,肺泡较完整。
7.透射电镜检查:C组毛细血管,肺泡Ⅰ型,Ⅱ型上皮结构正常；I/R组肺内毛细血管腔内炎症细胞作用,肺泡腔中有大量渗出,巨噬细胞活跃,Ⅰ型肺泡上皮细胞,吞饮小泡减少,Ⅱ型肺泡上皮细胞胞质水肿,核膜增粗扩张,板层小体减少、颜色变淡并大量脱落到肺泡腔内,线粒体肿胀,细胞核固缩,肺泡膈间质有水肿:IPC组肺组织损伤明显减轻,毛细血管和肺泡结构均有所改善,血管内皮细胞剥落减少,细胞核比较疏松,肺泡腔内渗出减少,巨噬细胞活跃,Ⅰ型肺泡上皮细胞水肿减轻,吞饮小泡增加,Ⅱ型肺泡上皮细胞板层小体增加,稍有水肿；IPO组肺组织损伤明显减轻,毛细血管和肺泡结构均有所改善,血管内皮肿胀减轻,核染色质趋均匀分布,肺泡腔内渗出减少,巨噬细胞不活跃,Ⅰ型肺泡上皮细胞吞饮小泡增加,Ⅱ型肺泡上皮细胞表面微绒毛增多,胞质中板层小体增加,但有少量空泡,肺泡隔仍较正常厚,尚有轻度水肿。
结论:
1.细胞凋亡可能在肺缺血/再灌注损伤中起重要作用。
2.给予缺血后处理对肺缺血/再灌注损伤具有防治作用。
3.缺血后处理可能通过提高机体的抗氧化能力,抑制中性粒细胞的激活、聚集,从而上调Bcl-2,下调促凋亡基因Bax的表达,提高Bcl-2/Bax比值以减少肺组织细胞凋亡,从而拮抗肺缺血/再灌注损伤。