论文部分内容阅读
生物传感器由于其具有成本低、选择性好、灵敏度高、分析速度快、能进行在线连续监测等优点,在实际分析检测和科学研究方面具有广阔的应用前景。银纳米簇和核酸探针在生物传感方面的广泛应用和取得的成果,为研究者提供了更多的传感设计思路。本论文基于银纳米簇和核酸探针在生物传感与生化分析应用方面的优势,同时结合巧妙的信号放大方式,致力于传感分析的研究热点,建立了多种生物传感和生化分析新方法用于mRNA的定量分析和小分子的高灵敏检测。本论文建立的分析方法操作简单,灵敏度高,特异性好且分析成本低,并初步显示了某些实际应用方面的检测能力。其具体内容如下：以寡聚核苷酸为模板合成的银纳米簇是常用的荧光纳米材料,但是由于银纳米的灵敏度不高限制了其在生物传感方面的发展。因此,我们利用杂交链式反应(HCR)来进行信号放大。在第1章,我们建立了基于HCR诱导银纳米簇荧光增强用于mRNA的检测。为了避免出现信号干扰,我们设计了四条发夹探针H1-H4,以及包含有银纳米簇DNA合成模版的NC探针,并对发夹探针H1的3’端设计了一段富G序列的拖尾、H3的5’端设计了能与NC探针的非银纳米簇模板部分互补的序列。目标物能够引发HCR反应,打开发夹H1,露出的H1能够打开H2,如此依次打开H3和H4,最后露出的H4的序列与mRNA引发链一致,因而能够再次打开新的H1,最后形成长链DNA聚合体结构,在该结构中不断的释放H1和H3的延长序列,由于H3能够与NC探针的一部分进行杂交,因而使得NC探针合成的银纳米簇与具有富G序列的H1靠近从而得到银纳米簇的荧光增强信号,而银纳米簇的荧光增强信号与目标物的浓度有关,因此实现对mRNA的定量分析。该方法灵敏度高,分析检测限为7 pM,能够实现对mRNA的突变分析。与传统的HCR放大方法相比,本章建立的方法操作简便,不需要任何化学标记。同时该方法能够用于复杂的细胞RNA提取物中mRNA的测定。裂开型核酸适配体是生物传感器的主要的机制之一。然而,目前的裂开型适配体传感设计由于缺乏耦合下游信号扩增方法而限制了分析方法的灵敏度。本论文第3章,我们发展了基于裂开型核酸适配体介导的内切酶扩增的适配体传感新方法(SAMEA)用于小分子的高灵敏检测。该设计思路依赖于我们的发现：以邻近杂交产生的DNA三通结构也能作为核酸内切酶IV (Endo IV)的底物,通过Endo IV循环剪切其中的检测探针,可以产生巨大的荧光激活式信号放大。基于此,通过对裂开型适配体的两条片段进行延长,利用分析物的诱导形成适配体片段夹心复合物,同时使得延长序列与检测探针邻近杂交,组装成DNA三通结构并结合EndoIV循环扩增,实现了分析物的高灵敏检测。利用可卡因作为该方法的模型检测对象,结果显示,基于裂开型核酸适配体介导的内切酶放大用于可卡因的检测限为7pM。相比于无放大的裂开型核适配体检测方法,该方法改善了大于105倍的灵敏度。同时,从血清样品的回收率结果可以看出,该方法在复杂体系中也具有良好的分析性能。