论文部分内容阅读
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的结核病,是当今世界由单一致病菌引起的死亡率最高的慢性传染病。随着人口数量的增长,人口流动速度的加快以及多重耐药菌株的出现,使得全球范围内结核病的发病人数再次上升。预防和控制结核病的主要任务就是及早发现,准确用药,这就对结核病的早期诊断提出了迫切要求。血清学诊断技术是目前实验室诊断肺结核的主要手段。寻找稳定、高效的结核菌抗原是关键。MPT63的在结核病致病菌株中特异表达,表达量在结核分枝杆菌分泌蛋白中占第三位。本实验研究目的是通过构建结核分枝杆菌MPT63蛋白的表达载体,在大肠杆菌Rosetta菌株进行诱导表达,获得大量重组MPT63蛋白抗原,为结核分枝杆菌感染的血清诊断奠定前期实验基础。从基因库中获得编码结核菌MPT63的编码基因,通过Primer Premier5.0软件设计1对特异性引物,以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,扩增出MPT63蛋白的基因片段,将目的基因克隆到原核表达载体pET-30a中,成功构建N端带有6XHis-tag的融合表达载体。测序结果分析正确后,利用化学法将重组表达载体转化到大肠杆菌Rosetta中,PCR检测筛选阳性工程菌株。经IPTG诱导SDS-PAGE分析,本实验成功获得表达MPT63重组蛋白的工程菌。经过梯度实验确定了MPT63重组蛋白在大肠杆菌中的最适表达条件为：2. Ommol/L IPTG,28℃,诱导5h,可达到最大表达量。表达产物主要以可溶性形式存在。应用Western Blot进行鉴定,杂交后有特异性条带出现,说明表达的蛋白为结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白,能够特异的被结核病病人血清识别。利用亲和层析方法对重组抗原进行了纯化。本实验先将MPT63,Rv3425,Mtb81单独用ELISA法进行抗体检测,然后再将三种蛋白联合进行ELISA检测。结果显示三种抗原单独检测结核病人血清抗结核抗体的敏感性为MPT63(18.75%),Rv3425(16.67%),Mtb81(20.83%),检测健康查体者对照血清特异性为MPT63(97.92%),Rv3425(95.83%),Mtb81(95.83%),联合抗原的敏感性为(37.5%),特异性为(91.67%)。表明联合重组结核分枝杆菌融合蛋白可以提高诊断的敏感性,但特异性较低。联合抗原具有一定的血清学诊断价值。