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苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus，ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(Applecholortoticleafspotvirus，ACLSV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus，ASGV)是栽培梨和苹果上最常见的病毒，经常复合侵染，梨树一旦带毒，终身受害，给梨树生产带来重大的损失。培育无病毒的梨树苗木，进行无病毒栽培是防治关键，而做好田间样品、脱毒苗木以及梨砧木样品的病毒检测工作，加强梨树主要病毒的检测，建立高效、灵敏的检测手段十分必要。本研究建立了多重PCR可以同时检测三种病毒适用于大批量样品检测，巢式PCR及环介导等温扩增方法检测灵敏度非常的高，主要工作如下: 1、本研究根据GenBank中登陆的ASPV和ACLSV的基因组序列，设计筛选出特异性检测ASPV和ACLSV的引物。确定了可同时检测梨ASGV、ACLSV和ASPV的多重RT-PCR引物组合:ASGVU/2-ACLSVA52/A53-ASPV247F/R，目标片段分别为500bp、358bp和247bp。同时对多重PCR反应体系和反应条件如引物和模板用量、退火温度等进行优化。灵敏度测定表明，多重RT-PCR方法检测灵敏度与常规单一RT-PCR基本一致。检测效果评价结果表明，多重RT-PCR方法能够同时适用于梨和苹果休眠枝条以及叶片等不同植物部位的三种潜隐病毒的扩增。通过对田间随机采集的36份梨样品的检测结果统计，该方法与单一RT-PCR检测一致率高达97.2％以上。目前该方法已应用于大量田间梨和苹果样品的高通量检测工作。 2、在已建立的多重RT-PCR基础上加入巢式PCR技术，建立了三种潜隐病毒的巢式-多重RT-PCR扩增方法。分别设计三种梨潜隐病毒的上游检测引物，和位于Poly(A)的M4一起作为巢式外侧引物，巢式内侧引物是已建立的多重RT-PCR引物。两套引物对模板进行两次扩增，提高了特异性，确保检测的准确性。巢式-多重RT-PCR可以很大程度上提高检测效率，其灵敏度是多重RT-PCR的105倍。目前该方法已应用于脱毒苗木以及砧木的检测工作，取得了良好的效果。 3、利用PrimerExplorerV4软件设计筛选了4条LAMP引物，并对LAMP反应体系中的dNTP浓度、Mg2+浓度以及反应温度梯度进行优化，确定最适反应条件。最终建立了能够特异性的扩增ASGV的LAMP扩增体系，LAMP反应产物经限制性内切酶酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳观察其片段大小与理论值相符合，建立的LAMP方法检测ASGV特异性高。该方法检测灵敏度是普通PCR的1000倍。在反应结束后，成功的通过肉眼观察焦磷酸镁白色沉淀判定反应是否顺利进行。