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昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内,二者互惠共生。昆虫病原线虫共生菌属于肠杆菌科、革兰氏阴性菌,包含3个属:致病杆菌属(Xenorhabdus)、发光杆菌属(Photorhabdus)和沙雷氏菌属(Serratia),分别与斯氏科(Steinernematidae)、异小杆科(Heterorhabditidae)和小杆科拟异小杆线虫属(Heterorhabditidoideschongmingensis)线虫共生。昆虫病原线虫共生菌为目前已发现的抗虫基因最多的细菌,其分泌的杀虫毒素蛋白对多种害虫具有杀伤作用,昆虫病原线虫共生菌已成为一类新的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。为寻找新的杀虫毒素资源,本研究对本实验室分离的昆虫病原线虫共生菌新种嗜线虫沙雷氏菌(Serratianematodiphila)的模式菌株DZ0503SBS1T的杀虫活性进行评价,研究其杀虫活性相关生物学特征,开展了杀虫毒素蛋白的分离纯化工作。主要研究内容如下:
共生菌菌株DZ0503SBS1T的生长曲线测定表明符合一般细菌的生长规律,共生菌在对数生长初期即产生胞外杀虫蛋白,在对数生长末期杀虫活力达到最大,在发酵26h时死亡率为100%,所以最优发酵时间为26h。
以大蜡螟为生测昆虫,对共生菌发酵液上清液对大蜡螟初孵幼虫和老熟幼虫的毒力进行测定,在100μl·g-1人工饲料时,96h后初孵幼虫校正死亡率为36.84%。体重抑制率为50.64%.老熟幼虫以10μl/头注射血腔内,12h后校正死亡率为94.74%。共生菌菌体以1000个/头、100个/头、10个/头注射大蜡螟老熟幼虫血腔内,12小时后的校正死亡率分别为88.89%、63.16%和42.11%。发酵液上清液中的杀虫物质对热比较稳定,60度处理30min后活力减小不大,死亡率仍达到80%;对蛋白酶K敏感,上清液蛋白酶K水解处理后杀虫活力下降40%.
共生菌胞外杀虫蛋白粗提物对大蜡螟初孵幼虫的胃毒毒力很高,在100μg·g-1人工饲料时,校正死亡率达到55%,生长抑制率也为74.67%。说明我们分离得到的共生菌胞外杀虫活力非常强。在将杀虫蛋白粗提物冻干粉OD280稀释为0.1,用微量注射器将稀释好的杀虫蛋白粗提物10μL注射到大蜡螟的血腔内,8h后大蜡螟校正死亡率为100%。
胞外杀虫蛋白粗提物冻干粉经Sephadex G-75凝胶过滤出现3个峰,检测胃毒活力时冻干粉以20μg·g-1加入人工饲料,实验结果显示峰2为活性峰,96h校正死亡率为50%,体重抑制率为86.30%.检测血腔毒力时以1μg·μ.l-1杀虫蛋白冻干粉注射大蜡螟,结果峰2为活性峰,12h的校正死亡率为68.42%。
过DEAE--Sephacryl阴离子交换柱,得到3个峰,检测胃毒活力时冻干粉以20μg·g-1人工饲料,峰3为活性峰,校正死亡率为45%。体重抑制率为48.43%。检测血腔毒力时以1μg·μl-1杀虫蛋白冻干粉注射大蜡螟,峰3为活性峰,12h的校正死亡率为50%。
SDS-PAGE电泳图谱显示,经过分子筛和离子柱分离纯化后的活性峰3为一明显蛋白条带,表明共生菌菌株DZ0503SBS1T的杀虫毒素蛋白由一条多肽链构成。根据蛋白Marker分子质量和电泳迁移率获得的线性曲线,结合活性峰3的电泳迁移率计算出该活性蛋白相对分子质量为49.6 kDa.由此可见,在经分子筛和离子交换后蛋白成分就比较简单,几乎没有其他杂蛋白。这为进一步分进行离纯化提供了实验基础。