论文部分内容阅读
甲基杆菌（Methylotrophs）是能利用一碳化合物（C1）如甲烷、甲醇和甲胺等为唯一碳源和能源的革兰氏阴性菌。在我国，甲醇产能严重过剩，同时，沼气甲烷资源综合利用率低，因而改造甲基杆菌生物催化C1合成高附加产品具有重要的研究价值。Methylobacterium extorquens AM1是研究C1代谢的模式菌株，其在以甲醇为碳源时，利用Ethylmalonyl-CoA（EMC）代谢途径生成乙醛酸回补丝氨酸同化途径，更重要的是EMC途径为合成高附加产品提供重要的前体物。3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化工产品，作为许多重要的工业产品的前体物，比如说丙烯酸，1,3-丙二醇和丙二酸等。本研究利用EMC途径的acetyl-CoA为前体物，通过异源表达mcr，该基因编码具有双功能malonyl-CoA还原酶，构建malonyl-CoA途径转化甲醇合成3-HP，并进一步解析3-HP在合成过程中由指数期向稳定期过渡时快速降解这一现象，为构建稳定、高效合成3-HP的工程菌株奠定基础。 首先构建启动子Pmeta1_3616过表达mcr，工程菌株表明3-HP在摇瓶产量为6.8 mg/L，为了进一步提高产量，我们构建了其他四个更强的启动子过表达mcr检测对3-HP产量和生长的影响，3-HP产量提高到52.8 mg/L，提高到是最初产量的7.8倍，生长没有显著性差异。根据报道Mcr-C与Mcr-N之间是不平衡的，并且Mcr-C是限速步骤，继而增加限速序列mcr550-1219拷贝数，3-HP的产量达到了69.8 mg/L。分析胞内acetyl-CoA的含量表明在3-HP最高产量菌株中acetyl-CoA含量下降65.0%，暗示着进一步调控acetyl-CoA含量可能会提高3-HP的产量。但是值得注意的是，工程菌株由指数期向稳定期过渡的生长过程中，前期生成的3-HP在大约10 h里下降到低于10 mg/L，因此解决这一问题尤为重要。 利用液相色谱飞行时间质谱（LC-QTOF）进行非靶向代谢组数据采集，运用MZmine、SIMCA-P和MassFrontier等生物学多元统计方法寻找生物标记物及定性，表明在外加3-HP到培养基的条件下，胞内有3-hydroxypropionyl-CoA(3-HP-CoA)新合成，推测3-HP首先转化为3-HP-CoA；利用液相色谱三重四级杆质谱联用（LC-QQQ-MS）和气相色谱质谱联用（GC-MS）检测胞内代谢物，靶向代谢组分析表明EMC途径的中心代谢物 propionyl-CoA、succinate、acetyl-CoA和?-hydroxybutyryl-CoA在外加3-HP到培养基的条件下分别提高了1.4、1.8、1.5、1.6倍。进而通过组合依赖β-alanine途径的13C动态示踪和体外酶活实验进一步表明3-HP主要通过还原途径同化，即3-HP转化为3-HP-CoA、acrylyl-CoA、propionyl-CoA，然后进入 EMC途径进行代谢；并且通过比较在外加3-HP与不加3-HP两种条件下，体外酶活反应检测还原途径代谢物并没有显著性差异，表明3-HP的还原途径并不是3-HP诱导性的。我们尝试探寻可能涉及到3-HP同化的相关基因，首先敲除dctA(META1_3271)基因，该基因编码的双羧酸转运蛋白酶，推测能够重吸收C3或C5酸，但是dctA的突变株并不能够减少3-HP的降解；根据报道DctA转运蛋白是一种Na+依赖性，通过降低60倍的Na+浓度，仍然不能够减少3-HP的降解，但是3-HP的产量提高到91.0 mg/L，主要原因是降低Na+浓度后，菌株比生长速率快了1.2倍。另外，我们对催化3-HP到3-HP-CoA和acrylyl-CoA到propionyl-CoA的酶，通过对M.extorquens AM1蛋白的氨基酸序列比对，发现有两个基因的序列一致性很高，META1_2054和META1_4251，分别达到了51%和59%，META1_4251基因编码的酶推测为acrylyl-CoA还原酶，该突变菌株在稳定后期使得3-HP的降解变慢，我们推测该基因可能涉及3-HP的同化；META1_2054编码的酶推测为CoA转移酶，然而，我们不能够筛选到突变株，暗示着这个基因可能对于M.extorquens AM1的生长有重要的功能，进一步通过体外纯化META1_2054编码的蛋白，并进行体外酶活反应，纯酶有很低的反应速率，暗示着META1_2054并不是3-HP还原途径第一步反应的关键基因。以后的研究将继续探寻涉及到3-HP同化的所有基因以稳定的产生3-HP。 综上所述，目前研究为进一步稳定、高效合成3-HP及其相关化学品提供重要研究基础，为基于甲基合成路线生产生物基材料提供了新的方案。