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目的:系统的研究小鼠胚胎干细胞的提取、体外培养扩增和向成骨细胞定向诱导分化。方法:用13.5d左右的昆明小鼠胚胎,采用常温消化法制备小鼠胚胎原代成纤维细胞(PMEF),加入专用的DMEM培养液,经丝裂霉素C处理后成为饲养层。在昆明小鼠受精后第4天,从子宫中取囊胚进行体外培养,4～5天后,获得大的巢式生长集落,使用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA,采用两步离散法,对内细胞团集落进行离散,接种在新鲜制备的饲养层体系中,加入适宜的含有白血病抑制因子(LlF)的培养基进行分化抑制培养,并进行传代和体外扩增。采用碱性磷酸酶染色、核型分析、类胚体实验对扩增细胞进行ESC鉴定。将小鼠5d龄ES-D3细胞源的类胚体(EBs)单细胞,按5×104/mL接种12孔细胞培养板,在DMEM基础培养基中使EBs单细胞贴壁培养。于第14～21天时,分别添加50μg/mL维生素C、50 mmol/Lβ-磷酸甘油、1μmol/L地塞米松(A组), 50μg/mL维生素C、50 mmol/Lβ-磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、10ng/mL骨形成蛋白2(B组),并设不添加诱导剂对照组(C组)。第22天时用1%茜素红染色显示阳性细胞,计算成骨细胞诱导形成率,数据用方差分析和多重比较检验。结果:成纤维细胞接种半小时后贴壁,可见细小突起长出,细胞呈梭形,核圆形。24小时后即可连生。ES细胞推开饲养层细胞生长,形成集落,集落边缘光滑清晰,有的集落边缘可见小的散在的ES细胞。细胞呈团状紧密排列,内部单个细胞辨别不清,每个细胞呈圆形,部分呈梭形,体积小,核大,胞浆少。细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性,为二倍体核型,可形成类胚体。表明培养扩增后的细胞具有ESC的典型特征。在EBs单细胞贴壁培养的第14～21d加入成骨诱导剂后,细胞形态发生改变,原来的球形细胞逐渐发出突起,变为多角形或短梭形的类成纤维细胞样,茜素红染色为红色,证明已转化为成骨细胞。结论:1.原代成纤维细胞分离方法简单,来源方便,细胞贴壁快,增殖迅速,作为饲养层能促进ES细胞的增殖并抑制其分化,因而非常适用于ES细胞的分离培养。2.维生素C、β-磷酸甘油、地塞米松、BMP-2组成的成骨诱导剂能够诱导ESC分化为成骨细胞,诱导分化率为29%左右。