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目的： 本研究通过将胰岛素生长因子1（ Insulin-Like Growth Factor-1, IGF-1)加入骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）培养液中刺激 BMSCs，探讨胰岛素生长因子1（IGF-1）对BMSCs增殖和凋亡的影响，并通过加入PI3K抑制剂LY294002和Akt磷酸化抑制剂MK2206验证IGF-1诱发BMSCs生物学特性改变具体的分子机制，为BMSCs在靶向治疗肿瘤中的安全应用提供实验基础。 材料与方法： 1.实验动物：SPF级雄性SD大鼠，3-4周龄，体重50g左右，购自重庆医科大学实验动物中心；实验细胞：贴壁法分离的SD大鼠BMSCs。2.实验分组：研究共分为两部分，第一部分分为以下4组：空白对照组：单独培养的BMSCs；实验组1：BMSCs+IGF-150ng/mL；实验组2：BMSCs+IGF-1150ng/mL；实验组3：BMSCs+IGF-1300ng/mL。第二部分分为以下4组：空白对照组：单独培养的BMSCs；实验组1：BMSCs+IGF-1；实验组2：BMSCs+IGF-1+LY294002抑制剂；实验组3：BMSCs+IGF-1+MK2206抑制剂。 实验方法：1.贴壁法分离筛选SD大鼠BMSCs，用倒置显微镜观察各组细胞形态；2.流式细胞术和间接免疫荧光法鉴定 BMSCs；3. CCK-8检测各组细胞增殖能力；4.流式细胞术检测各组细胞周期时相分布；5. JC-1检测细胞线粒体膜电位变化；6.细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力；7.β-半乳苷酶染色检测细胞衰老；8. Western Blot分析经不同浓度IGF-1刺激的BMSCs细胞p-Akt的蛋白表达水平；9. CCK-8细胞毒性实验检测抑制剂最佳工作浓度；10. Hoechst33342活细胞染色观察细胞核形态及凋亡比例；11. Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡能力；12. RT-PCR检测各组细胞Akt、Bad、Bcl-xl、c-Myc、STAT3的mRNA表达水平；13. Western Blot检测各组细胞Akt、p-Akt、p-Bad、Bad、Bcl-xl、c-Myc、p-STAT3、STAT3的蛋白表达水平。 实验结果： 1. SD大鼠提取的BMSCs用流式细胞技术鉴定，第三代骨髓间充质干细胞CD29的阳性表达率为99.9%，CD90的阳性表达率为98.8%，CD34和CD45均不表达。间接免疫荧光法检测得BMSCs CD90主要在胞核表达，CD105在胞浆和胞核均表达，CD45不表达。表明经大鼠提取原代BMSCs纯度较高，满足后续实验基本要求。2.倒置显微镜下观察到单独培养的BMSCs培养两周后空白对照组BMSCs贴壁生长，长梭形，呈旋涡状排列，折光性差。经IGF-1刺激2周后的细胞变细变尖，核质比增大，排列紊乱，细胞内颗粒增多，折光性增强。经LY294002和MK2206处理的细胞形态较经IGF-1刺激的细胞规整。3. CCK-8增殖实验发现，加IGF-1刺激组细胞与空白对照组细胞相比，细胞的增殖能力明显增强，差异有统计学意义(P＜0.05)：加阻断剂组处理的两组细胞与IGF-1刺激组相比增殖能力降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。4.流式细胞术检测细胞周期结果显示，加IGF-1刺激组细胞G2+S期细胞比例均明显高于BMSCs单独培养组。本结果表明IGF-1可增加 BMSCS的G2+S期细胞比例。5.通过流式细胞术检测线粒体膜电位变化发现，加IGF-1刺激的BMSCs同单独培养的BMSCs相比，线粒体膜电位下降的细胞比例明显下降，且具有浓度依赖性。表明细胞早期凋亡受到抑制。6.通过划痕实验发现，经三种不同浓度IGF-1刺激的BMSCs愈合能力均明显增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）。表明IGF-1能提升BMSCs的迁移能力。7.细胞衰老染色结果提示，而经IGF-1作用6d后BMSCs阳性细胞比例均明显低于BMSCS单独培养组，差异具有统计学意义（P＜0.05，P<0.01）。表明BMSCS在高表达IGF-1的异常微环境中长期培养后抗衰老能力明显增加，有潜在恶性转化的风险。8. Western Blot分析提示，经不同浓度IGF-1作用5d后的BMSCs，150ng/mL和300ng/mL浓度的IGF-1均可刺激BMSCs细胞p-Akt蛋白高表达，其磷酸化Akt的比例（pAkt/Akt）同空白对照组BMSCs相比，明显升高（P＜0.05，P<0.01）；其他浓度IGF-1作用的BMSCs与空白对照组BMSCs细胞的p-Akt蛋白表达无明显差异。9. CCK-8细胞毒性实验提示当LY294002工作浓度为5μmol/L时，细胞相对存活率大于85%，该浓度能够同时保证细胞活力和抑制作用。用相同方法处理细胞，MK2206的最佳工作浓度为5μmol/L。10.荧光显微镜下观察发现，经Hoechst33342活细胞染液处理后IGF-1刺激组细胞凋亡率较空白对照组凋亡率明显减低(P＜0.05)；加阻断剂组细胞凋亡率较IGF-1刺激组明显升高(P＜0.05)。11. Annexin V-FITC/PI双染法检测提示，IGF-1刺激组与空白对照组相比细胞凋亡率降低(P＜0.05)。阻断剂组(LY294002、MK2206)与IGF-1刺激组相比较细胞凋亡率增高(P<0.01)。12. RT-PCR结果显示，各组细胞Akt1表达无明显差异，IGF-1刺激组细胞Bad、Bcl-xl、c-Myc、STAT3的mRNA的相对表达量与空白对照组相比明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；加阻断剂组处理的两组细胞Bad、Bcl-xl、c-Myc、STAT3的mRNA的相对表达量与IGF-1刺激组相比显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。13. Western Blot结果提示，经IGF-1刺激的细胞p-Akt、p-Bad、Bad、Bcl-x l、c-Myc、p-STAT3、STAT3蛋白相对表达量均明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05，P<0.01)。 PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂MK2206均能阻断因IGF-1刺激引发的Akt和下游凋亡相关蛋白以及原癌基因的上调，差异有统计学意义(P＜0.05，P<0.01)。 结论： 1. IGF-1能够促进BMSCs通过细胞周期节点，上调BMSCs的增殖和迁移能力，并且能激活PI3K/Akt信号通路，上调Bad、Bcl-xl等凋亡调节蛋白从而抑制BMSCs的凋亡，原癌基因c-Myc、STAT3也存在异常激活，提示BMSCs在高表达IGF-1的异常微环境中存在恶性转化的倾向。2. Akt磷酸化抑制剂和PI3K抑制剂均能逆转BMSCs因IGF-1刺激引发的增殖和凋亡相关生物学特性变化，提示PI3K/Akt信号通路是IGF-1引发BMSCs转化过程中的关键信号转导通路。