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海洋是地球上最大、最古老的生境,海洋面积约占地球表面积的70%,海洋生境构成复杂多变。各种生境赋予海洋微生物耐酸、耐碱、耐热、耐冷、耐盐、耐压等特性。在海洋极端微生物的研究中嗜热微生物的研究占据很重要的地位,高温微生物由于其生长环境特殊,代谢类型多样,因而具有广泛的理论研究与实际应用价值。
本研究对18份海洋沉积物样品,在55℃,68℃和80℃的培养温度下,分别采用好氧培养与厌氧培养方式,在自养型培养基与异养型培养基上对高温菌进行分离;同时分析了不同pH值梯度的培养基,以及100℃干热处理、85℃热激、热激后55℃富集培养等预处理方式对高温菌出菌率的影响。pH梯度条件下分离结果显示,在pH7和9的情况分离到的菌株最多,在pH5和3条件下没有分离到菌株,表明分离样品中高温菌的适宜生长pH值可能为中性偏碱。预处理实验结果表明在含5%脱脂牛奶、10mM天冬酰胺、10mM葡萄糖、10mM果糖、10mMKCl的海水中,85℃热激10分钟后,于55℃、200rev/min富集培养7天后能够较为明显地促进出菌,获得的细菌类群也相对其它预处理方式丰富。最终在55℃培养条件下分离到细菌134株,分属于17个属,其中芽孢杆菌98株,占55℃所获菌株的73.1%;68℃培养条件下分离到细菌62株,其中高温放线菌科菌株27株,占68℃所获菌株的43.5%,80℃条件下没有获得可培养菌株。
基于16SrRNA基因序列,对所获菌株进行鉴定,结果表明所有菌株分布于6科(芽孢杆菌科、短杆菌科、博戈里亚湖菌科、类芽孢杆菌科、动性球菌科、高温放线菌科)19属(气芽孢杆菌属、厌氧芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、短小芽孢杆菌属、短杆菌属、链孢高温放线菌属、地芽孢杆菌属、乔治菌属、克洛普斯泰德氏菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、梅尔吉菌属、海洋芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、滨海芽孢杆菌属、类芽孢八叠球菌属、平线菌属、糖球菌属、高温放线菌属、枝芽孢杆菌属),其中有27株菌与己知物种的16SrRNA基因序列相似性小于97%,可能是潜在的新分类单元。在所有菌株中芽孢杆菌所占比例最大,为53.6%;其次是高温放线菌科的成员,占17.8%。通过形态特征、生理生化特征、化学分类特征、基因组DNAG+Cmol%和基于16SrRNA基因序列系统发育分析等对菌株SCSIO15096T,SCSIO15020T和SCSIO15042T进行了多相分类研究,确定了它们的分类地位。菌株SCSIO15096T代表了海洋芽孢杆菌新属新种(Oceanibacillusindicagen.nov.,sp.nov.);菌株SCSIO15020T和SCSIO15042T分别代表了新物种沉积物乔治菌(Georgeniasediminissp.nov.)和深海芽孢杆菌(Bacillusabyssalissp.nov.)。
根据鉴定结果,选择30株属于不同类群的代表性菌株进行温度耐受和海水依赖实验,结果表明芽孢杆菌属菌株主要是耐热性菌株和兼性耐热菌株,而嗜热菌则分布于短小芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属和厌氧芽孢杆菌属;海水对不同耐热菌和兼性耐热的菌株的生长影响不一样,嗜热菌在海水配制的培养基中生长相对在纯水配制的培养基中缓慢。蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶活性检测结果表明,在所有被检测的30株菌中(其中芽孢杆菌20株),表现出蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶活性的菌株分别有16株(53.3%)、14株(46.6%)、9株(30%)和11株(36.7%)。其中具有蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶活性的芽孢杆菌分别有13株(81.2%)、10株(71.4%)、7株(77.8%)、7株(63.6%)。在所有检测的菌株当中,菌株SCSIO15150(Bacillussp.)和SCSIO15153(Oceanobacillussp)表现出最强的淀粉酶活性,其水解圈与菌落直径之比为4.83;菌株SCSIO15135(Bacillussp.)、SCSIO15034(Bacillussp.)、SCSIO15188(Aeribacillussp.)分别表现最强的蛋白酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶活性,其对应的水解圈与菌落直径之比分别为3.2、9.3、4.1。菌株SCSIO15029(Bacillussp.)、SCSIO15034(Bacillussp.)、SCSIO15058(Brevibacteriumsp)、SCSIO15061(Brevibacteriumsp.)、SCSIO15121(Bacillussp.)同时具备四种酶活性。
本研究结果显示海洋沉积物中存在大量的高温菌,并呈现出较好的多样性,且其中不乏新的分类单元,其中有些高温菌具有较好的产酶特性,为微生物的遗传与分类研究以及工业应用提供较好的菌种资源。