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牛泡沫病毒(Bovine Foamy Virus,BFV)是反转录病毒科泡沫病毒亚科泡沫病毒属的成员,该病毒具有复杂的基因组结构和独特的基因表达调节过程与传统的反转录病毒区别较大。它的基因转录受到两个启动子的调节,其中位于5’端的LTR负责结构基因的转录,位于env基因内部的启动子IP则调节BTas等非结构蛋白的合成,并且这两个启动子的活性都可被BTas蛋白激活。目前已经清楚,LTR和IP中的Tas应答元件(TRE)为病毒复制所必需,并且BTas可以结合于LTR上的TRE片段,本文即进一步在BTas与TRE的具体作用机制方面进行了一些研究。
利用本室分离的牛泡沫病毒BFV3026中国毒株为材料,主要进行了如下几个方面的工作：(1)通过构建BTas蛋白一系列缺失体的原核表达质粒,对若干BTas缺失蛋白进行表达纯化。利用纯化的缺失蛋白以及制备TRE片段作为探针进行体外结合实验,通过凝胶阻滞分析BTas的DNA结合结构域；(2)对已知TRE序列进行截短实验,以期将TRE区域进一步界定,从而确定与BTas结合的最小区域；(3)在将TRE缩短之后,进行激活功能研究：一方面通过缺失截短后的TRE片段以分析其在BTas激活过程中的作用,另一方面构建仅含应答元件的质粒,以检测该片段能否独立应答BTas的激活。
BTas应答元件分为TREI和TREII,本文选择TREII通过缺失实验对其精细结构进行凝胶阻滞分析,发现了一段22bp的碱基序列为BTas最小结合区,命名为Minimal TRE Domain, MTD。序列比对发现,在TREII序列内至少存在4个MTD。MTD突变序列分析证明,BTas与MTD的结合是直接的和特异性的,即BTas只能与特定的DNA序列识别并结合。利用Luc报告基因验证了,在第四个MTD缺失的情况下BTas的激活作用受到了显著的抑制；在串联2个MTD存在的情况下BTas可以行使激活功能,第四段MTD对于应答BTas的激活有着最为重要的作用。对BTas蛋白进行了DNA结合结构域的划分,证实了BTas的N端为DNA结合相关的结构域,与C端的激活结构域无重叠。在BFV内部启动子IP上也存在相似的MTD片段,并且可以与BTas直接结合推测也具有激活转录的功能。