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目的：
通过构建原核表达载体，获得阴道毛滴虫黏附蛋白65基因重组融合蛋白，分析免疫原性及免疫反应性，检测重组蛋白免疫动物后体内免疫指标，为后续动物免疫保护实验及致病机理研究奠定基础。
方法：
1、原核表达载体的构建、表达、纯化及鉴定
分离并纯化培养阴道毛滴虫临床分离株，提取其总RNA，经RT-PCR扩其全长序列基因，T-A克隆测序后，连接表达载体pET-28a(+)。在Ecoli(DE3)plysS宿主菌中用不同浓度IPTG诱导目的蛋白表达，采用Ni-NTA亲和层析法提纯AP65，SDS-PAGE检测表达和提纯效果，采用兔抗阴道毛滴虫全虫多抗鉴定其免疫反应性。
2、兔抗阴道毛滴虫重组蛋白AP65的多克隆抗体的制备、纯化及鉴定
采用日本大耳兔多次免疫重组蛋白AP65后，用饱和硫酸铵法和nproteinAsepharose4FF柱纯化多克隆抗体，间接ELISA先摸索抗原的最适包被浓度，后检测其血清抗体效价，western-blot检测免疫原性。
3、免疫效应的初探
融合蛋白免疫清洁级BALB/c小鼠于2、4、6周血清IgG、IgA抗体产生情况及未次免疫流式细胞检测CD4+/CD8+表达，不同浓度融合蛋白刺激BALB/c小鼠脾细胞后，检测72小时后上清IFN-r、IL-2、IL-4、IL-6四种细胞因子的表达情况。
结果：
1、pET-28a(+)原核表达载体的构建及诱导表达
克隆ap65基因与GenBank公布基因同源性高，在1mmol/LIPTG诱导下，AP65产量可占细菌总蛋白量的23％，提纯后蛋白纯度达到89.6％，且重组蛋白AP65能与兔抗阴道毛滴虫全虫抗体发生特异性结合，重组蛋白且有良好的免疫反应性，成功地构建了阴道毛滴虫ap65基因的原核表达系统。
2、兔抗AP65融合蛋白的多克隆抗体的制备及鉴定
第三次加强免疫后，硫酸铵法纯化多克隆抗体纯度达到56％，而后采用亲合层析柱nproteinAsepharose4FF再次纯化多克隆抗体达到80％，间接ELISA检测抗原的最适包被浓度为6.0μg/ml，血清效价达到1:25600。western-blot鉴定重组蛋白AP65能与兔抗重组蛋白AP65多克隆抗体结合，成功地制备了抗阴道毛滴虫重组蛋白AP65高效价、高纯度多克隆抗体。
3、免疫效应的初探
荧光标记CD4+/CD8+流式检测比值较正常对照组有升高，血清抗体IgG、IgA在免疫6周后，比正常对照组OD值有明显升高，脾细胞培养上清液IFN-r、IL-2表达量较正常对照组没有明显差异，而IL-4、IL-6表达量明显高于对照组。
结论：
本实验成功构建原核表达载体pET28(+)-ap65,诱导表达出与理论大小相一致的重组蛋白，经Ni-NTA亲和层析法纯化，制备出高纯度的融合蛋白，免疫日本大耳兔后，通过硫酸铵法和亲合层析法可获得高纯度的多克隆抗体，间接ELISA检测血清，效价达到满意效果。融合蛋白能明显诱导脾细胞表达IL-4和IL-6两种细胞因子，具统计学意义，而IFN-r、IL-2表达量没有明显变化。IgG和IgA血清抗体OD值高于对照组，且CD4+/CD8+比值有升高，说明重组蛋白可使机体产生强的免疫反应，从细胞因子的表达情况和血清抗体的升高，可能以体液免疫反应为主，该实验的研究为疫苗抗原的筛选奠定了理论基础。