重组人源化抗CD52单克隆抗体生物学活性检测方法的优化及验证

• 作 者: 钟艳君
• 出 处: 上海交通大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 重组人源化抗CD52单克隆抗体 CDC 方法学验证

药物的生物学活性评价,是药物研究开发过程中的重要环节,是判定药物是否具有研究价值及确定研究方向的关键评价点。对重组抗体进行体外生物学活性评价,可为产品的工艺研究优化提供方向,保证生产过程中的质量把控。本论文以重组人源化抗CD52单克隆抗体为目标药物,建立和优化ATP法测定药物补体依赖细胞毒性(CDC)的检测方法。重组人源化抗CD52单克隆抗体是仿制国外已上市药物Campath研究开发,测定抗体CDC活性时,以Campath作为参考对照品,以两者的相对CDC活性来评价本抗体的生物学活性。ATP法测定抗体CDC活性基于使用荧光素酶系统对三磷酸腺苷(ATP)浓度的测定,由于ATP在细胞死亡后迅速降解,其浓度与细胞数量有关,同时荧光素光的强度又与ATP浓度呈线性关系。生物测定中由于各个水平的偏差趋势可对测定结果产生巨大影响,因此对各因素偏差趋势的限制有助于提高方法的准确性,通过对靶细胞的研究筛选,选取最适合该检测的目标细胞,对反应体系,标准曲线、补体等关键因素进行优化,得到稳定精确的检测方法并进行验证。结果将单克隆抗体酶解后,利用液相色谱仪分离检测各肽段,两种抗体液相图谱表现一致,CDR区的保留时间基本相同。单克隆抗体糖基在糖苷酶作用下与抗体分离,经2-AB荧光标记后,经HPLC对比保留时间来定性糖成分,以峰面积计算各糖基组分含量,两种单抗糖基化修饰图谱基本一致,各组分含量基本相似。可确认重组人源化抗CD52单克隆抗体与市售Campath具有相似的抗体结构和功能。市售Campath可作为CDC相对活性参比品。应用流式细胞仪检测经CD52-FITC标记的HUT78、MC/CAR、Ramos细胞,比较细胞表面CD52抗原表达量及稳定性。HUT78、MC/CAR、Ramos细胞都为高表达CD52抗原细胞,CD52抗原表达量从高到低依次为MC/CAR、HUT78、Ramos细胞。CD52抗原表达稳定性由高到低依次为Ramos、MC/CAR、HUT78细胞。重组人源化CD52单克隆抗体CDC细胞毒性方法优化及验证试验表明:Ramos细胞是作为CDC效应细胞毒性检测的最优靶细胞;专属性验证同型对照抗体人IgG与靶细胞无反应,无杀伤作用。将参比品Campath制备成50%、75%、100%、125%及150%理论效价样品,同时检测后,计算其相对活性,再与理论效价对比,平行试验3次,得出本方法回收率在90%-115%之间,三次平行试验间,5组理论效价相对CDC活性与回收率RSD值均在6%以内;使用参比品Campath重复实验6次,计算相对CDC活性在94%-113%之间,RSD值低于7%;日间精密度及人员精密度小于15%。结论重组人源化抗CD52单克隆抗体与市售Campath具有相似的关键质量属性和生物学活性。在生物学活性研究方面,通过对重组人源化抗CD52单克隆抗体CDC活性方法优化及验证,表明该方法具有较高的准确性和精密度,且特异性良好,线性及耐用性符合要求。本方法操作简便,可对抗CD52抗体药物体外活性提供快速准确的评价,为抗CD52抗体药物的研发提供有力的数据依据,并明确工艺研究开发的方向,促进药物的尽早开发和应用。