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人胚胎干细胞(hESCs)有分化为机体各种细胞的潜能，是再生医学、药物筛选及发育研究的一个重要来源。hESCs是从人胚胎细胞分离培养而来的，然而，人胚胎来源不足严重限制了hESCs的研究。以动物卵母细胞为受体、人体细胞为供体细胞的异质核移植技术为hESCs的研究提供了新的途径，本文尝试了用山羊卵母细胞为受体、人包皮成纤维细胞(HFFs)为供体构建人-山羊异质核移植(human-goat interspecies nuclear transfer, hgiNT)胚胎，并分离hESCs，旨在优化hgiNT方案，并为建立hESCs系提供技术帮助。研究内容如下：
1.为了选择遗传均一的供体细胞用于核移植，本实验分别用条件培养液或用饲养层共培养对HFFs进行克隆分离和扩大培养，对照组在无饲养层的新鲜培养液中培养，Giemsa染色分析克隆细胞核型。结果：共培养组克隆存活率(31.43 %)显著高于对照组(5.56 %)(P＜0.05)，与条件培养液组相近(27.27%，P＞0.05)；饲养层共培养组扩大培养率(11.43 %)显著高于对照组(0 %)(P＜0.05)。7个细胞克隆中5个表现为正常核型(2n=44+XY)。结果表明，两种方法均能提高HFFs形成克隆的比例，且能保持细胞染色体核型正常，用于核移植前供体细胞的筛选。
2.为了探索hgiNT条件，本实验首先对电融合参数进行了摸索，进而测试了融合与激活间隔时间对重组胚胎体外发育的影响，最后对比了mSOFaa和G1/G2序贯培养法对重组胚胎体外发育的影响。结果最佳的融合电压、脉冲时程和脉冲次数分别为36V、20μs和2次，最佳的融合与激活间隔时间为4h，G1/G2序贯培养法的卵裂率和囊胚率均显著高于mSOFaa培养法(71.81%vs.64.78%，9.73%vs.4.76%；P＜0.05)。结果表明：hgiNT的电融合参数及融合与激活间隔时间与受体卵母细胞供应方(山羊)体细胞核移植相似，而核移植胚胎的培养条件倾向于供体细胞供应方(人)的胚胎培养条件。
3.本研究探讨了TSA对供体细胞或重构胚处理对hgiNT胚胎发育的影响。选择经5、25、50、75、100nMTSA处理24h的山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行核移植，结果在50、75nM组，囊胚率有所增高(9.91%、12.10%vs.8.47%，P＞0.05)；用5，25，50，75或100nMTSA处理重构胚10h，结果5、25、50、75nM组的囊胚率均有所提高，其中25nM组显著高于对照组(16.41%vs.7.63%，P＜0.05)。TSA处理供体细胞和重构胚均能显著提高克隆胚囊率，说明低甲基化的供体细胞有利于卵母细胞的重编程，推测TSA可能降低了核移植后供体细胞组蛋白去乙酰化水平，因而提高了克隆胚的发育率。
4.本实验(1)用10mg/L的丝裂霉素-C分别处理HFFs、MEFCs和GEFCs饲养层1.5h、2h、2.5h、3h，冷冻-复苏后培养12h，统计复苏率，选择合适的处理时间；(2)用HFFs、MEFCs和GEFCs作饲养层，接种ICM，比较它们对hESCs的支持情况；(3)在不同密度的HFFs饲养层上，接种相同的ICM数，统计hESCs的贴壁率、克隆形成率、分化率，从中选择合适的饲养层密度。结果显示：(1)以10mg/L丝裂霉素-C最佳处理时间为2h；(2)HFFs和MEFCs饲养层均能有效地支持hESCs增殖和保持未分化状态；(3)HFFs饲养层的最佳密度是3×104/mL。
五、为了克服培养体系中异源性成份污染hESCs临床应用的限制，本实验采用无动物源性成份确定的HESCO体系对hgiNT胚胎来源的hESCs(iNT-hESCs)进行体外培养(HESCO组)，以HFFs为饲养层的常规培养体系为对照组(HFF组)，观察iNT-hESCs在两种培养体系中的生长状况，探讨HESCO体系对iNT-hESCs生长的支持情况。结果，HESCO组的iNT-hESCs有与HFF组相似的细胞形态、增殖速度、碱性磷酸酶活性和遗传稳定性；结果表明HESCO培养体系能支持iNT-hESCs的生长并能保持其未分化状态，这对iNT-hESCs用于临床治疗且有重要意义。
1.为了选择遗传均一的供体细胞用于核移植，本实验分别用条件培养液或用饲养层共培养对HFFs进行克隆分离和扩大培养，对照组在无饲养层的新鲜培养液中培养，Giemsa染色分析克隆细胞核型。结果：共培养组克隆存活率(31.43 %)显著高于对照组(5.56 %)(P＜0.05)，与条件培养液组相近(27.27%，P＞0.05)；饲养层共培养组扩大培养率(11.43 %)显著高于对照组(0 %)(P＜0.05)。7个细胞克隆中5个表现为正常核型(2n=44+XY)。结果表明，两种方法均能提高HFFs形成克隆的比例，且能保持细胞染色体核型正常，用于核移植前供体细胞的筛选。
2.为了探索hgiNT条件，本实验首先对电融合参数进行了摸索，进而测试了融合与激活间隔时间对重组胚胎体外发育的影响，最后对比了mSOFaa和G1/G2序贯培养法对重组胚胎体外发育的影响。结果最佳的融合电压、脉冲时程和脉冲次数分别为36V、20μs和2次，最佳的融合与激活间隔时间为4h，G1/G2序贯培养法的卵裂率和囊胚率均显著高于mSOFaa培养法(71.81%vs.64.78%，9.73%vs.4.76%；P＜0.05)。结果表明：hgiNT的电融合参数及融合与激活间隔时间与受体卵母细胞供应方(山羊)体细胞核移植相似，而核移植胚胎的培养条件倾向于供体细胞供应方(人)的胚胎培养条件。
3.本研究探讨了TSA对供体细胞或重构胚处理对hgiNT胚胎发育的影响。选择经5、25、50、75、100nMTSA处理24h的山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行核移植，结果在50、75nM组，囊胚率有所增高(9.91%、12.10%vs.8.47%，P＞0.05)；用5，25，50，75或100nMTSA处理重构胚10h，结果5、25、50、75nM组的囊胚率均有所提高，其中25nM组显著高于对照组(16.41%vs.7.63%，P＜0.05)。TSA处理供体细胞和重构胚均能显著提高克隆胚囊率，说明低甲基化的供体细胞有利于卵母细胞的重编程，推测TSA可能降低了核移植后供体细胞组蛋白去乙酰化水平，因而提高了克隆胚的发育率。
4.本实验(1)用10mg/L的丝裂霉素-C分别处理HFFs、MEFCs和GEFCs饲养层1.5h、2h、2.5h、3h，冷冻-复苏后培养12h，统计复苏率，选择合适的处理时间；(2)用HFFs、MEFCs和GEFCs作饲养层，接种ICM，比较它们对hESCs的支持情况；(3)在不同密度的HFFs饲养层上，接种相同的ICM数，统计hESCs的贴壁率、克隆形成率、分化率，从中选择合适的饲养层密度。结果显示：(1)以10mg/L丝裂霉素-C最佳处理时间为2h；(2)HFFs和MEFCs饲养层均能有效地支持hESCs增殖和保持未分化状态；(3)HFFs饲养层的最佳密度是3×104/mL。
五、为了克服培养体系中异源性成份污染hESCs临床应用的限制，本实验采用无动物源性成份确定的HESCO体系对hgiNT胚胎来源的hESCs(iNT-hESCs)进行体外培养(HESCO组)，以HFFs为饲养层的常规培养体系为对照组(HFF组)，观察iNT-hESCs在两种培养体系中的生长状况，探讨HESCO体系对iNT-hESCs生长的支持情况。结果，HESCO组的iNT-hESCs有与HFF组相似的细胞形态、增殖速度、碱性磷酸酶活性和遗传稳定性；结果表明HESCO培养体系能支持iNT-hESCs的生长并能保持其未分化状态，这对iNT-hESCs用于临床治疗且有重要意义。