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目的：
与动物比较,人类肿瘤的发生机制非常复杂。深入研究功能尚不清楚的肿瘤相关基因包括癌基因将有助于完全阐明人类肿瘤的发生机制。TRE17是一个功能尚不清楚的癌基因,其导致正常细胞恶性转化的机制有待阐明。初步明确TRE17与肌球蛋白调节性轻链(myosinregulatory light chain,MLC2)之间的相互作用将有助于深入研究TRE17在细胞骨架重塑和肿瘤发生中的作用,为肿瘤的诊断、预防和治疗提供初步线索。
方法：
为研究TRE17癌蛋白与MLC2蛋白之间的相互作用,用RT-PCR方法,从制备的HeLa细胞总RNh中扩增了MLC2蛋白的cDNA完整开放读码框架(open reading frame,ORF),并插入pGEX-6P-1载体,构建了GST-MLC2融合蛋白原核表达质粒MLC2/pGEK;在将pGEX-6P-1和MLC2/pGEX质粒分别转导入大肠杆菌BL21,并经IPTG大量诱导表达GST和GST-MLC2蛋白后,在非变性条件下(超声破碎仪裂解细菌菌体)用Glutathione Sepharose 4B对GST和GST-MLC2蛋白分别进行了亲和纯化。用HA-TRE17(447)蛋白真核表达质粒HA-TRE17(447)/pcDNA3转染培养的HeLa细胞,以GST蛋白为对照,将纯化的GST-MLC2蛋白与该转染细胞裂解物进行GST pull-down分析；沉淀的蛋白进行SOS-PAGE后,用抗HA抗体进行WesternBlot分析,以检测沉淀中的HA-TRE17(447)蛋白。
以pGEX-6P-1为载体,分别构建了GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco融合蛋白原核表达质粒GST-TRE17(447)/pGEX和GST-TRE17onco/pGEX;转导入大肠杆菌BL21后,用IPTG大量诱导表达和在非变性条件下纯化了GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco融合蛋白；在用PreScissionTM蛋白酶切除GST-MLC2蛋白中的GST标志蛋白后,以GST蛋白为对照,将获得的不含GST标志蛋白的MLC2蛋白分别与GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco融合蛋白进行GST pull-down分析；沉淀的蛋白进行SDS-PAGE后,用考马斯亮蓝染色观察沉淀中的MLC2蛋白,以探讨TRE17癌蛋白是否直接结合MLC2蛋白。
结果：
构建的GST-MLC2融合蛋白原核表达质粒MLC2/pGEx经BamH和EcoR I双酶切后出现525 bp特征性片段,MLC2 cDNA序列经测序证实无误。大肠杆菌BL21在分别用MLC2/pGEX和pGEX-6P-1转化后,由IPTG诱导表达的蛋白分子量均符合预期,为46.6 kDa(GST-MLC2融合蛋白)和28.4 kDa(GST蛋白),而未经IPTG诱导的阴性对照,则未见相应部位出现蛋白条带。诱导表达GST-MLC2和GST蛋白的细菌菌体被用超声破碎仪裂解,并经Glutathione Sepharose 4B亲和纯化后,GST-MLC2和GST蛋白纯度已达90％以上。以GST蛋白为对照,用GST-MLC2融合蛋白与经HA-TRE17(447)蛋白真核表达质粒HA-TRE17(447)/pcDNA3转染的HeLa细胞裂解物进行GST pull-down实验后,用抗HA抗体进行Western Blot分析,显示MLC2蛋白与TRE17(447)结合,而阴性对照GST蛋白并不结合TRE17(447),证实MLC2蛋白特异性结合TRE17(447)。
经BamH I和Xho I双酶切后,GST-TRE17(447)/pGEX质粒出现1360 bp特征性片段,而GST-TRE17onco/pGEX质粒出现2415 bp特征性片段。TRE17(447)和TRE17onco cDNA序列经测序证实无误。大肠杆菌BL21分别用GST-TRE17(447)融合蛋白表达质粒GST-TRE17(447)/pGEX和GST-TRE17onco融合蛋白表达质粒GST-TRE17onco/pGEX转化后,由IPTG诱导表达的蛋白分子量均符合预期,大约为78.3 kDa(GST-TRE17(447)蛋白)和116.4 kDa(GST-TRE17onco蛋白)。而未用IPTG诱导的对照,则未见相应部位出现蛋白条带。在非交性条件下,GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco蛋白被用Glutathione Sepharose4B进行了初步亲和纯化。以GST蛋白为对照,用纯化的GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco蛋白分别与不含GST标志蛋白的MLC2进行GST pull-down分析,显示MLC2蛋白能特异性直接结合TRE17(447)蛋白,而不能结合阴性对照GST蛋白；而TRE17onco蛋白即使与MLC2能直接结合,也要比TRE17(447)弱得多。
结论：
TRE17癌蛋白能特异性直接结合MLC2蛋白。