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随着全球气候变暖,高温对植物的生长发育和各种生理生化过程造成了严重的影响,成为了影响农作物生产的重要非生物胁迫因子。研究植物在抵抗和适应高温过程中形成的应答和调控机制,已成为当前植物科学研究的一大重点。番茄（Solanum lycopersicum）是全球普遍栽培的蔬菜之一,也是高等植物基因功能研究的重要模式植物之一,利用番茄来揭示植物的抗高温机制,可以为培育抗高温新品种奠定一定的基础。bZIP转录因子是普遍存在于植物中的一类转录因子,大量研究表明,bZIP家族转录因子参与多种生物学过程,目前,关于番茄中bZIP转录因子在高温方面的研究还比较匮乏,因此,探究番茄中bZIP家族基因在高温胁迫条件下的表达与调控、解析其分子机制具有重要意义。本研究通过前期的基因芯片筛选和分析,发现番茄bZIP家族转录因子SlbZIP2基因在高温处理时表达上调,推测其可能参与番茄的高温胁迫反应。本研究以SlbZIP2基因为研究对象,扩增该基因全长片段并进行生物信息学分析,利用定量PCR对该基因进行表达分析和诱导因素分析,通过遗传转化获得转基因植株并对其后代植株进行高温处理,观察其在高温胁迫下的表型并测定相关生理指标和探究相关基因的表达变化,进而分析该基因在适应番茄高温胁迫过程中的功能。主要研究结果如下:1.SlbZIP2基因的克隆及生物信息学分析以野生型番茄AC++的c DNA为模板,利用特异性引物经高保真酶进行扩增获得621 bp的SlbZIP2基因目的序列,测序确定SlbZIP2基因含有441bp的CDS序列,预测该基因编码146个氨基酸,其分子量为16.69 KD,根据其氨基酸序列推测该蛋白是一个不稳定的亲水蛋白。分析SlbZIP2基因启动子区域,发现其序列中存在38种元件,其中包括脱落酸反应中的顺式作用元件、参与光响应的顺式作用元件、赤霉素反应元件等。通过分析番茄bZIP转录因子家族的保守结构域,发现SlbZIP2具有bZIP家族转录因子的两个保守结构域。2.SlbZIP2基因的表达模式分析以野生型番茄AC++的根、茎、幼叶、成叶、老叶、花、萼片和果实各时期的样品RNA为材料,利用q RT-PCR分析SlbZIP2基因的表达情况,结果表明,该基因在野生型番茄的各个部位均有表达,其中根和花中的表达量最高;在果实的发育和成熟过程中,基因的表达量比较稳定,没有随着成熟时期发生明显的增减。3.SlbZIP2基因的逆境诱导因素分析通过对野生型番茄AC++进行非生物胁迫处理,包括高温、低温、干旱、淹水和盐胁迫。收取根、茎、叶的样品并提取RNA,利用q RT-PCR分析SlbZIP2基因在各种非生物胁迫处理下不同组织和部位的表达情况,结果表明:（1）高温胁迫可以显著诱导SlbZIP2基因的表达,而且在一定范围内,高温胁迫时间越长,基因的表达量越高;（2）在低温处理下,相对于对照处理,SlbZIP2基因的表达没有发生明显变化,可能低温不是诱导SlbZIP2基因表达的因素;（3）干旱胁迫能诱导SlbZIP2基因表达,并且解除干旱胁迫后,随着植株失水状态的缓解,基因的表达量也逐渐降低;（4）在淹水处理下,SlbZIP2基因在叶中的表达量随着处理时间的增加逐渐增高,而在茎和根中,基因的表达无显著变化;（5）盐胁迫是诱导SlbZIP2基因表达的因素,并且盐浓度越高,基因的表达量越高。4.SlbZIP2超表达载体与CRISPR/Cas9载体的构建及番茄的遗传转化对目的基因和p VCT2024载体进行双酶切后,回收片段,用T4连接酶进行连接,将连接产物转化大肠杆菌,最终成功构建了p VCT2024-SlbZIP2超表达载体;通过对突变位点设计引物,并利用PCR扩增以获得相应突变位点的片段,再对p KSE401载体进行酶切,回收目的片段和载体的大片段,用T4连接酶进行连接,然后将连接产物转化大肠杆菌,成功构建了CRISPR/Cas9载体。采用农杆菌介导法,将超表达载体转入野生型番茄AC++,获得了转基因阳性组培苗,成功获得了6个超表达转基因株系,分别为OE-4、OE-6、OE-7、OE-8、OE-11和OE-12;同时将CRISPR/Cas9载体转入番茄,获得了转基因阳性组培苗,尚未获得基因编辑的株系。5.转基因番茄的高温胁迫处理及表型观察选取超表达株系中表达量最高的三个株系（OE-6、OE-11和OE-12）的T2代植株和野生型番茄AC++,待植株长到五叶一心时期,对转基因番茄和野生型番茄同时进行42℃高温胁迫处理和25℃对照处理,高温胁迫处理下3 d后,野生型番茄AC++叶片失水严重,而转基因番茄植株叶片的失水程度比野生型番茄轻,植株整体也只有轻度萎蔫。高温胁迫对野生型番茄造成的伤害明显强于转基因番茄,说明转基因植株对高温胁迫的耐受性强于野生型,表明SlbZIP2基因的超表达增强了番茄植株的耐热性。6.高温胁迫处理后相关生理指标的测定收取高温胁迫处理前后的番茄样品,对相对电导率、叶绿素含量、脯氨酸含量和丙二醛含量这几项生理指标进行测定。结果发现,在高温胁迫处理后,超表达植株叶片的相对电导率显著低于野生型植株,叶绿素含量和丙二醛含量也低于野生型,而脯氨酸含量高于野生型。这些生理指标反映出转基因番茄植株更能抵御高温胁迫、细胞膜系统的稳定性更强,表明SlbZIP2基因的超表达增强了番茄对高温胁迫的耐受性。7.高温胁迫处理后相关基因的表达情况分析在高温胁迫处理后,收取转基因番茄和野生型番茄叶片的样品,分析SlbZIP2基因高温相关基因、ABA信号途径相关基因的表达情况。结果表明,在高温胁迫下,Hsf A1、Hsf A2、Sl SIZ1、Sl AREB1、Sl PP2C2、Sl TASI4和Sl NCED等多个基因的表达发生了显著变化,推测SlbZIP2可能参与ABA信号途径,可能通过调控相关基因的表达进而影响番茄对高温胁迫的抵抗能力。