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具有营养和医药价值的重组人乳清白蛋白(rHLA)和人乳铁蛋白(rHLF)已经分别在牛乳腺生物反应器中得到了高效的表达,但是这些重组蛋白质的纯化存在特殊的困难。牛乳中含有大量的牛源蛋白质,包括酪蛋白胶体颗粒和牛乳清蛋白质。由于目标蛋白质与牛自身表达的牛乳清白蛋白(BLA)和乳铁蛋白(BLF)蛋白质之间存在高度的同源性,分离难度很大。为了有效地从重组牛乳中纯化目标蛋白,我们进行了如下的研究工作:
1)牛乳预处理方法的研究。本文系统地考察了三种常用牛乳预处理方法的应用范围以及在这些方法中不同乳清蛋白质的回收率。结果表明,凝乳酶法和钙盐沉淀法的应用范围较宽,可以沉淀初始蛋白浓度为10-80g/L脱脂乳中的酪蛋白；酸沉淀法的应用范围略窄,无法沉淀初始蛋白浓度高于60g/L脱脂乳中的酪蛋白。凝乳酶法中乳清蛋白质的回收率最高,可以达到90％以上；钙盐沉淀法中的大部分乳清蛋白质的回收率较高,但是乳清白蛋白(α-LA)的回收率较低(30％-80％)；酸沉淀过程中由于存在包裹效应和共沉淀效应,rHLA的回收率略低(76.1％)。
2)同源蛋白质性质的研究。本研究通过对同源乳清蛋白质氨基酸序列的分析和计算比较了了它们在疏水性、静电电势和分子量等理化性质方面的异同。结果表明,同源蛋白质的分子量非常接近,而疏水性和静电电势有一定的区别。在此基础上建立了鉴定两对同源蛋白质的高效反相检测方法,并定量检测了重组牛乳中两对同源蛋白质的含量,结果显示rHLA浓度1.2～1.5g/L,BLA浓度约1.1g/L,rHLF浓度2.5～3.4g/L,BLF浓度约0.1g/L。
3)重组人乳清白蛋白的纯化研究。本研究比较了离子交换层析和疏水层析分离同源乳清白蛋白的效果。结果表明,同源乳清白蛋白在离子交换层析中的分离度不高。通过层析条件的优化,我们通过非钙离子依赖型的丁基疏水层析有效地分离了rHLA和BLA,并以疏水层析为核心建立了两条rHLA的纯化工艺,目标蛋白回收率分别为67.1和48.6％,所得产品中BLA含量<5％,产品纯度>90％。对纯化所得转基因蛋白性质鉴定的结果表明,rHLA与天然蛋白分子量相同(14,078 Dalton),具备天然的二级结构,无糖基化,具备调节β-1,4-半乳糖苷转移酶促乳糖合成的生物活性。
4)重组人乳铁蛋白的纯化工艺及中试放大。使用SP阳离子交换层析可以从重组牛乳中高效地纯化rHLF,并有效地去除rHLF产品中痕量的BLF蛋白。在此基础上我们完成了5批次200L转基因牛乳的纯化中试,得到了3.11Kg的rHLF纯品。目标蛋白回收率约72％,产品纯度>95％,所得产品中牛乳铁蛋白含量<5％。对纯化所得rHLF进行了性质鉴定,结果表明,rHLF分子量为79,481 Dalton,具备正常铁离子吸附解吸活性和抗菌活性。