论文部分内容阅读
胶质瘤是较为难治的中枢神经系统肿瘤，TCGA数据分析发现，相比与其他肿瘤，胶质瘤中巨噬细胞标记蛋白和M2型标记蛋白表达更高，已有文献发现，脑肿瘤中巨噬细胞比例可达30％。同时，M2型巨噬细胞是肿瘤生长、免疫逃逸和治疗抵抗的关键原因。那么，抑制巨噬细胞聚集和向M2型巨噬细胞极化将成为胶质瘤治疗的潜在方向。免疫相关GTP酶家族M蛋白(IRGM)参与多种免疫炎症疾病和黑色素瘤的发生发展，同时小鼠Irgm1能够促进巨噬细胞向M1型分化。预实验发现，胶质瘤中IRGM蛋白主要表达在胶质瘤细胞中，而非胶质瘤相关巨噬细胞中，TCGA数据库mRNA转录组学分析发现，胶质瘤病人IRGM和M2型巨噬细胞标记CD206和CD163表达成正相关。本课题将深入研究IRGM对于胶质瘤微环境中巨噬细胞聚集和M2表型极化的的作用及分子机制，从而揭示胶质瘤免疫抑制微环境形成的重要机制，为阐明胶质瘤发生发展、抑制免疫逃避、防控胶质瘤治疗抵抗奠定理论基础。 免疫组化分析IRGM在三个级别胶质瘤中表达，发现胶质瘤IRGM蛋白表达量比非肿瘤脑组织显著增高，但不同级别间无明显差别。相比于星形细胞，IRGM在多种胶质瘤细胞系中表达较高。使用IRGM敲减细胞系建立裸鼠胶质瘤皮下模型，发现IRGM敲减抑制了肿瘤生长，但对肿瘤细胞密度和形态无明显影响。TCGA数据库分析可见，巨噬细胞标记CD11b、C68、CD163和IL-10mRNA在胶质瘤中表达较高。胶质瘤临床标本中CD206表达增加，且IRGM评分与外周血单核细胞百分比、CD206表达量临床评分正相关。IRGM敲减组皮下胶质瘤组织中IRGM、MIP-3a、CD11b和CD206均明显减少。IRGM敲减细胞系上清中细胞因子检测结果表明，IL-8和MIP-3a表达明显改变。IRGM敲减细胞系和巨噬细胞共培养，结果显示，IRGM敲减抑制了M2型巨噬细胞形态的形成。同时，IRGM敲减抑制了M2巨噬细胞标记CD206和Arg1的表达。另外，共培养后流式检测M2细胞比例，结果说明IRGM敲减组M2细胞比例显著降低。中和共培养体系中IL-8或MIP-3α，巨噬细胞向肿瘤迁移的数量均明显降低，中和IL-8可以抑制M2细胞极化比例，但MIP-3α不影响M2比例。为了深入研究IRGM调控IL-8产生的分子机制，检测了IRGM敲减细胞系磷酸化蛋白组学改变，蛋白差异分析发现，IRGM显著促进336个蛋白磷酸化，抑制59个蛋白磷酸化;KEGG信号通路富集分析揭示，IRGM调控的磷酸化蛋白显著富集在NF-κB信号通路中，此通路可调控IL-8转录。Western blot实验证明IRGM促进NF-κB p65、TAK1和IκBα磷酸化，以及NF-κB入核。进一步分析与IRGM相互作用蛋白，免疫沉淀/蛋白质谱分析发现，与IRGM互作的蛋白包括脆性X智力低下蛋白(FMRP)和翻译起始因子(eIFs)，FMRP和eIFs能够调控RNA出核和翻译。因此，推测，IRGM可能通过影响FMRP、eIFs与mRNA绑定促进IL-8mRNA的出核和翻译。 综上所述，证实了IRGM在胶质瘤组织和细胞中高表达，并促进胶质瘤细胞产生IL-8和MIP-3α，进而促进巨噬细胞聚集和极化，IRGM通过促进TAK1磷酸化进而活化下游NF-κB通路活化，促进IL-8转录。本研究为重塑胶质瘤免疫抑制微环境提供了新靶点。