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目的:支气管哮喘（Bronchial asthma）是由气道炎症细胞（如树突状细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等）、结构细胞（如气道上皮细胞）和细胞组分共同参与的气道慢性炎症性疾病。当过敏原进入气道后,即被抗原呈递细胞捕获,呈递给CD4+T细胞。抗原呈递的最重要条件是在呈递部位有IL-4以及某些决定T细胞分化为Th2细胞的辅助受体的参与。Th2细胞产生IL-4、IL-3和IL-5等细胞因子,其中IL-4和IL-3诱导浆细胞产生IgE,通过高亲和性受体FcεRⅠ结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞上。当相应抗原与IgE结合时,会产生一个激动信号使细胞（主要是肥大细胞）活化,导致各种化学介质的释放。组胺和LTs等生化介质可引起局部组织效应,包括气道平滑肌收缩、组织水肿、黏液分泌增加和神经刺激症状等,最终导致搔痒和打喷嚏。IL-18是IL-1家族中一种多效促炎性细胞因子,在固有免疫和适应性免疫中起重要作用。研究发现IL-18变异与哮喘严重程度显著相关。IL-18和IL-18R在致命性哮喘患者肺内强烈表达,提示IL-18在哮喘中起作用。另一方面,哮喘尤其是难治性哮喘患者的痰液上清液中IL-18水平明显低于正常人,这种变化与巨噬细胞的数目成正比,与中性粒细胞的百分比成反比,与嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）和嗜酸性粒细胞不相关。为了进一步了解IL-18在哮喘中的潜在作用,在本研究中我们检测了血液嗜碱性粒细胞和痰液肥大细胞中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达。研究发现,链格孢提取物诱导培养后,正常人支气管上皮细胞迅速释放IL-18并通过NF-κB依赖途径直接启动幼稚CD4+T细胞的Th2极化。还有研究发现IL-18与肥大细胞和嗜碱细胞分泌IL-13相关,提示过敏原可能通过IL-18引起过敏性气道反应,而IL-18能够影响肥大细胞和嗜碱性粒细胞的功能。由于肥大细胞和嗜碱性粒细胞是哮喘中的关键细胞类型,它们可以产生一系列不同的细胞因子,因此它们可能是IL-18的主要来源。通过研究IL-18、IL-18BP和IL-18R的相关机制,我们研究了肥大细胞和嗜碱性粒细胞在哮喘中的潜在作用,并进一步探究了IL-18相关机制在哮喘发病中的作用。由于嗜碱性粒细胞的数目极少,我们将通过树突状细胞（Dendritic cells,DCs）进一步研究IL-18等细胞因子分泌的机制。DCs是哮喘发病的始动者,能够驱使CD4+幼稚型T细胞活化并向Th2细胞分化,在维持免疫反应和免疫耐受方面发挥关键的作用。DCs细胞监视环境的受体有多种,包括Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）。LPS是TLR4受体激动剂,同时也是实验和临床上的高效佐剂之一。TLR4受体不同于其他的TLR受体,它的下游信号可以通过两个独立的通路传导。第一个通路依赖于MyD88转接蛋白。MyD88信号通路在促炎性因子（如IL-6和TNF-α）释放中有非常重要的作用,但研究发现共刺激分子的上调是不需要MyD88信号通路的,由此发现了第二个通路MyD88非依赖性信号通路,这个通路依赖于TRIF转接蛋白。先前的研究表明TRIF对LPS激活后共刺激分子的上调非常关键,在这篇文章中,共刺激分子上调被认为是IFN-I受体通路的结果。然而,这篇文章主要是观察巨噬细胞的,DCs细胞是否通过同样的机制产生同样的结果,我们不得而知。在本实验中,我们将探究DCs细胞识别尘螨过敏原是通过MyD88信号通路完成的还是通过TRIF通路完成的还是二者缺一不可,以及是通过哪些信号分子来触发NF-κB的,分泌了哪些细胞因子群,为揭示树突状细胞参与HDM诱导的免疫应答提供新的依据,为哮喘及其他相关过敏性疾病的发病机制提供新的理论基础。研究方法:第一部分:本研究共招募了31名哮喘患者和14名健康对照（HC）受试者。入院收集哮喘患者（急性加重阶段）的血液,门诊收集HC受试者的血液,每个个体抽取10 mL外周血置于EDTA管中。哮喘患者深度咳嗽排痰,无菌杯收集痰液,每名患者至少收集5毫升痰液。流式细胞术分析人嗜碱性粒细胞和肥大细胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达,检测哮喘患者痰液中肥大细胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达。BALB/c小鼠（5-6 w,18-22 g）小鼠在第0、7、14和21天皮下多点注射OVA溶液（含OVA 50μg、Al（OH）3 1.5 mg）。于第25天,致敏小鼠气管内注射0.1 mL 5%OVA溶液（含或不含10 ng/m L IL-18）3小时,然后单侧肺注入1 m L的生理盐水（含有1 mM EDTA）2 min,收集支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）。摘除眼球收集小鼠血液,颈椎脱臼法处死小鼠,消化肺组织,流式细胞术分析小鼠外周血嗜碱性粒细胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达,检测小鼠BALF和肺组织中肥大细胞IL-18BP、IL-18R的表达,夹心ELISA检测小鼠血浆IL-18BP的水平。第二部分:收集健康对照和HDM+哮喘患者血清,利用CD14+免疫磁珠从人外周血分选CD14+单核细胞,诱导分化成DCs细胞。用健康对照血清、哮喘患者血清孵育DCs细胞,LPS作为阳性对照,孵育24h。收集DCs细胞,ELISA检测DCs细胞上清IL-6的分泌情况。Western blot观察TLR4、TLR2、MyD88、MAPKs和NF-κB的表达变化。结果:第一部分:1.HC和哮喘血液中约53%和51%的嗜碱性粒细胞表达IL-18,HC和哮喘血液中超过85%和81%嗜碱性粒细胞表达IL-18BP。然而,HC和哮喘血液中只有19.8%和8.6%的嗜碱性粒细胞表达IL-18R,与HC血液相比哮喘患者血液中IL-18R+嗜碱性粒细胞减少56.4%;2.CD34-FcεRIα+CD117+肥大细胞仅由约0.39%分散的有核细胞组成,仅有3.5%、14.3%和2.4%表达IL-18、IL-18BP和IL-18R。3.致敏小鼠血液中的IL-18BP+嗜碱细胞比例明显下降,但IL-18R+嗜碱性细胞显著增加;4.致敏和IL-18增加了BALF中肥大细胞的数量,IL-18增强了IL-18BP+肥大细胞的表达;5.IL-18增强了OVA致敏小鼠肺中肥大细胞的数量和IL-18R+肥大细胞的百分比;6.IL-18注射使非致敏和OVA致敏小鼠的血浆中的IL-18BP水平分别增加48.0%和16.1%。第二部分:1.在HDM+哮喘患者血清的微环境下,MDDC细胞通过TLR4来识别HDME。2.单独的HDM+哮喘患者血清即可刺激MDDC细胞MyD88表达增加,在血清中加入高剂量的HDME,MDDC细胞MyD88表达变化更为明显。3.健康血清和哮喘血清均导致MDDC细胞中ERK、p38的磷酸化增加。4.HDM+哮喘患者血清对MDDC有作用,促进NF-κB的易位。5.AS plasma+HDME 10组MDDC细胞IL-6分泌升高,SB203580和U0126均抑制了MDDC细胞IL-6的分泌。结论:第一部分:1.人外周血中50%嗜碱性粒细胞表达IL-18,80%嗜碱性粒细胞表达IL-18BP,嗜碱性粒细胞参与哮喘的发病与IL-18无关。2.哮喘患者痰液中仅有0.39%的有核肥大细胞,IL-18+肥大细胞比例降低,导致哮喘痰液中IL-18水平降低。3.致敏对小鼠肺组织肥大细胞的数目、肥大细胞IL-18BP和肥大细胞IL-18R的表达没有影响。4.外源IL-18增强OVA致敏小鼠BALF和肺组织中肥大细胞以及IL-18R+肥大细胞的数目,肥大细胞通过IL-18相关机制参与哮喘的发病。第二部分:1.过敏性哮喘血清和MDDC细胞共培养可以模拟整体情况下的DCs细胞在哮喘微环境中的变化。2.HDME激活MDDC细胞TLR4信号通路,可能通过MyD88/ERK/p38/NF-κB信号通路诱导炎症反应。