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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种接触传染、高致死率的猪传染病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的疫病,病死率高达100%,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。2018年ASF传入我国,由于缺乏有效疫苗,已给我国养猪业造成无法估量的经济损失,严重影响了我国整个生猪产业链。该病的病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),ASFV为大型双链DNA病毒,其全基因组在170-193 kb之间,不同毒株约包含151-167个基因不等。纳米抗体(Nanobody,Nb)是存在于骆驼科动物体内,天然缺失轻链和重链第一恒定区的一种单链抗体。该抗体具有分子量小,稳定性高,易于基因改造的优点,近年来已被广泛应用于人和动物疫病的诊断和治疗中。然而,关于纳米抗体在ASFV诊断和防治中的应用却一直未见相关研究报道。本研究利用原核表达ASFV-p72蛋白免疫双峰驼,构建噬菌体文库,通过噬菌体展示技术筛选获得了针对p72蛋白的纳米抗体。随后,将筛选的纳米抗体与辣根过氧化物酶(HRP)进行融合表达,并利用该融合蛋白建立了一种快速检测猪血清中抗ASFV抗体的竞争ELISA。本研究的取得的主要结果简述如下:1.ASFV-p72蛋白的原核表达与纯化参考Gen Bank上ASFV中国分离株的B646L基因序列,通过基因合成、PCR扩增、酶切、连接和转化,成功构建了ASFV-p72蛋白的原核表达载体p ET-28a-ASFV-p72。然后,通过IPTG诱导表达,超声裂解以及镍柱亲和层析纯化,SDS-PAGE显示获得了预期75 k Da纯化的重组p72蛋白,该蛋白以包涵体的形式存在。Western blot分析表明表达的重组p72蛋白能够与ASFV阳性猪血清反应,具有良好的反应原性。2.抗ASFV-p72蛋白纳米抗体库的构建以及特异性纳米抗体的筛选将纯化的ASFV-p72蛋白免疫双峰驼,5次免疫后,间接ELISA检测免疫骆驼血清中抗p72蛋白的抗体效价达1:256000。采集骆驼外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,经巢式RT-PCR、酶切、连接和电转化大肠杆菌TG1细胞后,成功构建了库容为3.8×10~7且多样性丰富的纳米抗体噬菌体展示文库。随后,用已纯化的p72蛋白作为包被抗原,利用噬菌体展示、筛淘技术,经3轮淘选,成功筛出9株抗ASFV-p72重组蛋白的特异性纳米抗体,命名为Nb1-Nb9。间接ELISA分析纳米抗体Nb4的阻断效果最好。3.基于纳米抗体-HRP融合蛋白建立检测猪血清中抗ASFV抗体的竞争ELISA基于前期建立的纳米抗体与HRP融合蛋白的快速表达平台,采用酶切、连接和转化构建真核表达载体p EGFP-N1-p72-Nb4-HRP,转染HEK293T细胞后,经IFA和直接ELISA结果显示纳米抗体Nb4与HRP融合蛋白成功在HEK293T细胞中分泌表达。对该融合蛋白的亲和力验证发现,其与p72蛋白的亲和力效价达10~4。利用棋盘滴定法确定建立的竞争ELISA的最佳抗原包被量为80 ng/孔,融合蛋白的最佳稀释度为1:100,待检猪血清最佳稀释度为1:40,确定该方法的Cut-off值为30.8%,且该方法敏感性高,特异性强,操作简单,在临床样品检测中与商品化试剂盒具有96.3%的符合率。综上所述,基于纳米抗体的优势,本研究成功筛选获得了9株抗ASFV-p72蛋白的特异性纳米抗体,随后利用纳米抗体-HRP融合蛋白表达平台成功制备了抗ASFV纳米抗体与HRP的融合蛋白,并利用该融合蛋白建立了快速检测猪血清中抗ASFV抗体的竞争ELISA方法。该方法具有操作简单,敏感性强,特异性高和生产成本低的优点,为猪群中ASFV感染的监测以及该病的防控奠定了基础。