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登革热是世界卫生组织定义的严重威胁人类健康的典型的热带病毒病，极易造成局部以至大面积爆发流行。登革病毒为其唯一的病原体，以伊蚊属蚊虫为传播媒介，其还可进展引发登革出血热和登革休克综合症的致命并发症。登革热广泛流行于全球热带及亚热带，是分布最广，发病最多，危害较大的一种传染病，但是目前流行区域呈不断扩大趋势，已广泛扩散流行到非热带地区。我国登革热主要在发生在珠江三角洲地区并不断向北方扩散，曾发生过数十万人的大流行，近年来还爆发过千人以上的大流行。但是，目前国内外尚无有效疫苗用于预防，也无针对病毒的特效治疗药物。因此，亟待发展新型有效的登革预防控制策略和特异治疗新方案。 干扰素诱导跨膜蛋白家族(Interferon-inducible transmembrane proteins，IFITM)已发现十来年，但是关于其正常生理状态下生物学功能的研究一直不清晰。2009年有研究者发现其高效的抗流行性感冒病毒的活性，参与了宿主的天然抗病毒免疫，并且是目前发现的第一个且唯一一个以抑制病毒复制周期的穿入阶段的抗病毒蛋白。近三年来相继揭示了IFITM蛋白具有针对甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)、西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)、登革病毒(Dengue virus，DENV)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)、马尔堡病毒(Marburg virus，MARV)、埃博拉病病毒(Ebola，EBOV)、严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS coronavirus)、人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus，HW)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的抗病毒活性，IFITM蛋白广谱抗病毒活性以及独特的抗病毒机理使其成为近年来的抗病毒天然免疫研究中的明星分子。但是，IFITM蛋白在宿主细胞中参与抑制病毒穿入的具体分子机制，以及该蛋白参与宿主的抗病毒天然免疫的作用方式尚未明确还有待深入研究。外泌体(exosome)又称胞外体，是由细胞内的多泡体(multivesicularbody，MVB)与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种膜性囊泡(vesicles)，可参与细胞内的mRNA、DNA、蛋白质等生物大分子转运到细胞外基质中，并能发挥相应的生物学功能。目前已成为细胞.细胞间物质传递方面研究的一个新兴领域。 本研究主要目的为系统研究IFITM3蛋白的抗登革病毒活性；探讨IFITM3蛋白是否存在细胞外形式，并阐明其具体细胞外蛋白形式是否为分泌蛋白形式，或是外泌体形式；研究IFITM3外泌体的抗登革病毒活性及其分子机制。 主要研究内容包括： 1.登革病毒感染能诱发宿主细胞IFITM3蛋白高表达 本研究通过Western blotting技术检测了一系列登革病毒易感细胞在病毒感染后的细胞内IFITM蛋白表达情况，验证了登革病毒刺激可激发宿主细胞IFITM蛋白水平急剧升高。 2.宿主细胞IFITM蛋白表达差异与登革病毒感染相关 通过Western Blotting技术检测各细胞的IFITM3蛋白的内源性基础表达，以及各细胞的登革病毒的易感性，结合Spearman等级相关系数分析发现宿主细胞IFITM蛋白表达差异与登革病毒感染呈负相关。 3.1 FITM蛋白的抗登革病毒感染研究 (1)高表达IFITM蛋白抑制登革病毒感染 通过逆转录病毒表达质粒pMSCV-puro-IFITM1-HA、pMSCV-puro-IFITM2-HA及pMSCV-puro-IFITM3-HA，与包装质粒pIK用磷酸钙法共转染HEK-293T细胞，制备病毒感染登革病毒易感细胞THP-1和HeLa，嘌呤霉素筛选建立稳定高表达IFITM的THP-1和HeLa细胞。Western blotting检测证明稳定高表达IFITM1、IFITM2、IFITM3的易感细胞THP-1-IFITM1，2，3和HeLa-IFITM1，2，3构建成功。随后，采用流式细胞技术检测登革病毒对各细胞THP-1-Vector、THP-1-IFITM1，2，3和HeLa-Vector、HeLa-IFITM1，2，3的感染性。结果显示，外源性稳定高表达IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白均能较强的抑制登革病毒的感染。并且，采用磷酸钙转染法将pMSCV-puro-IFITM1-HA、pMSCV-puro-IFITM2-HA及pMSCV-puro-IFITM3-HA克隆质粒瞬时转染进HEK-293T细胞，通过Western Blotting检测HA标签蛋白以判定三种蛋白的表达水平高低，再应用流式细胞技术检测各细胞对登革病毒的感染性。由此，根据三种细胞相比较可推断出IFITM3在HEK-293T易感细胞中的抗登革病毒感染活性最强。 (2)沉默IFITM表达能增强登革病毒感染 首先，我们首先选取一株内源性表达IFITM3蛋白较高的易感细胞HUVEC，采用脂质体法将Scramble-RNAi对照寡核苷酸片段(对照组)，以及针对IFITM3设计的两个寡核苷酸片段IFITM-siRNAi-1和IFITM-siRNAi-2转染进HUVEC以沉默其IFITM表达，结果表明沉默内源性IFITM3蛋白表达能较强的抑制登革病毒的感染。再者，我们选用一株内源性表达IFITM3蛋白较低的易感细胞HeLa，采用脂质体法将Scramble-RNAi、IFITM-siRNAi-1和IFITM-siRNAi-2转染进IFN-β刺激后的HeLa细胞，以沉默降低干扰素激发的IFITM的表达，结果表明沉默外源激活IFITM3蛋白表达能较强的登革病毒的感染，并能逆转IFN-β的抗登革病毒感染作用。 (3)IFITM3蛋白能抑制登革病毒复制周期的穿入 我们采用吸附试验和穿入试验检测IFITM3对病毒复制周期的具体作用阶段。结果显示，DENV-2 NGC病毒株感染HeLa细胞模型中，IFITM3对病毒吸附无明显的抑制作用，但对病毒的穿入具有较强的抑制作用。 4.IFITM蛋白外泌体形式的抗登革病毒感染研究 (1)IFITM3存在细胞外蛋白形式 采用磷酸钙转染法将pMSCV-puro-IFITM1-HA、pMSCV-puro-IFITM2-HA及pMSCV-puro-IFITM3-HA克隆质粒瞬时转染进HEK-293T细胞后，我们收集细胞转染48 h后的培养基上清，采用超滤管富集法使其浓缩10倍。通过Westernblotting检测发现培养基上清中能检测到IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白，这表明IFITM存在细胞外蛋白形式。 (2)IFITM3蛋白的细胞外形式为外泌体 我们采用超速离心技术，针对于IFITM内源性高表达的易感细胞HUVEC培养基上清，IFN-β刺激后的HEK-293T细胞培养基上清，以及瞬时高表达外源性IFITM3的HEK-293T细胞培养基上清，分别从以上三种上清中分离纯化获得外泌体。将所获的外泌体负染操作后，应用透射电子电镜观察可见外泌体囊泡形状物(大小40-100nm)。通过Western blotting检测，以外泌体的标志蛋白Flotillin-2作为对照，结果显示均检测到外泌体中存在IFITM3蛋白。采用SDS-PAGE电泳分离外泌体后，银染凝胶并切下目的条带，再应用质谱技术分析鉴定获得氨基酸序列与人类基因库比对分析后，结果确证为IFITM3蛋白序列，证明外泌体中该蛋白条带为IFITM3。综上所述，我们证明IFITM3是以外泌体形式分泌到细胞外。 (3)IFITM3可以外泌体形式在细胞间传递 本研究采用超速离心技术，针对于IFITM内源性高表达的易感细胞HUVEC培养基上清，IFN-β刺激后的HEK-293T细胞培养基上清，瞬时高表达外源性IFITM3的HEK-293T细胞培养基上清，以及HEK-293T-Vector细胞培养基上清，分别从以上四种上清中分离纯化获得外泌体。分别以总蛋白浓度60μg的IFITM3外泌体作用于HeLa细胞，提取各组细胞总蛋白经Western blotting检测发现三种来源的IFITM3外泌体处理后，HeLa细胞中IFITM3均呈明显增多趋势，并具浓度依赖性及时间依赖性效应。这说明IFITM3外泌体可在细胞间进行传递。 (4)IFITM3蛋白外泌体形式具有抗登革病毒活性 分别以20μg、60μg不同浓度的293T-IFITM3-Exosome和HUVEC-IFITM3-Exosome作用于HeLa细胞24 h后，再以病毒滴度为1 MOI的DENV-2 NGC病毒株感染24 h后，分别提取细胞的总RNA以及培养基上清中总RNA，应用相对定量法Real time RT-PCR方法检测细胞内感染的病毒RNA，以GAPDH作为内源性对照：并应用绝对定量法Real time RT-PCR检测培养基上清中病毒RNA。结果表明IFITM3外泌体具有明显的抗登革病毒感染活性，并呈浓度依赖性效应(图24及图25)。 并且，分别以20μg、60μg不同浓度的293T-IFITM3-Exosome作用于BHK-21细胞24 h后，再以病毒滴度为1 MOI的DENV-2 NGC病毒株感染24 h后，采用MTS比色法检测登革病毒感染BHK-21细胞所致细胞病变效应。结果显示IFITM3外泌体处理组BHK-21细胞存活率呈增加趋势，因此，IFITM3外泌体能抑制登革病毒感染BHK-21细胞所致细胞病变效应。 (5)IFITM3外泌体能抑制登革病毒复制周期的穿入 我们采用吸附试验和穿入试验检测IFITM3外泌体对病毒复制周期的抑制作用机理。结果显示，DENV-2 NGC病毒株感染HeLa细胞模型中，IFITM3外泌体对病毒吸附无明显的抑制作用，但对病毒的穿入具有较强的抑制作用。 本研究在细胞模型上系统的阐明了干扰素介导产生IFITM1、IFITM2、IFITM3的抗登革病毒感染的功能及分子机制，阐明其为参与宿主的天然抗病毒免疫的重要免疫因子。特别是首次发现一种干扰素诱导的抗病毒蛋白IFITM3蛋白作为外泌体的新型生物活性形式，并阐明IFITM3外泌体通过抑制登革病毒复制周期的穿入后与宿主细胞的膜融合阶段，从而建立了以IFITM3包装的外泌体抗登革病毒的新策略。