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致泻性大肠杆菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)和弯曲菌(Campylobacter spp.)均为重要的食源性致病菌,它们广泛存在于自然界,可造成急性肠道感染和严重腹泻,是食品安全隐患。了解它们的流行特征、致病性和抗生素耐药特征对预防和控制大肠杆菌和弯曲菌感染具有重要意义。本课题研究了上海市致泻大肠杆菌和弯曲菌的耐药性、毒力基因和分子流行病学特征,并对多重耐药弯曲菌的耐药分子机制做了初步探索。主要研究结果如下:1、致泻性大肠杆菌的毒力基因和耐药特征致泻性大肠杆菌是导致世界范围细菌性肠炎的食源性致病菌。本论文利用上海市四家医院从7204份腹泻病人粪便样本中分离出735株(10.2%)致泻性大肠杆菌为材料开展大肠杆菌的毒力基因和抗生素耐药性分析研究。其中有6122份粪便样品来自中国人,分离出594株(9.7%)大肠杆菌,1082份来自居住在上海的外国人,分离出141株(13.1%)大肠杆菌,外国人的腹泻粪便大肠杆菌分离率高于中国人。来自5岁以下儿童的299株大肠杆菌以肠致病性大肠杆菌为主,而从19-60岁以上成人分离的365株大肠杆菌以产肠毒素大肠杆菌为主。肠致病性大肠杆菌(n=374,50.9%)和产肠毒素大肠杆菌(n=318,43.3%)为上海市致泻性大肠杆菌的主要亚型,其中肠致病性大肠杆菌均携带eae基因,为非典型性肠致病性大肠杆菌。318株产肠毒素大肠杆菌中携带肠毒素est A,elt A和est A-elt A的菌株分别有189株(59.6%)、89株(27.8%)和40株(12.6%)。此外,鉴定出7株产志贺毒素大肠杆菌,分别有5株和2株携带了毒力基因stx1和stx2。检测了735株大肠杆菌分离株对16种临床常用抗生素的耐药情况,其中分离株对链霉素(90.7%)、氨苄西林(63.4%)、萘啶酸(61.1%)、磺胺异恶唑(49.1%)、四环素(41.2%)、甲氧苄氨嘧啶(35.6%)和复方新诺明(35.4%)的耐药率较高,对阿莫西林/克拉维酸(27.2%)、头孢噻肟(24.5%)、头孢吡肟(23.5%)、庆大霉素(16.7%)、头孢他啶(12.4%)、氯霉素(10.6%)、环丙沙星(7.2%)和氧氟沙星(3.4%)也出现耐药,无菌株对亚胺培南耐药,多重耐药菌株占比高达65.4%。2、产肠毒素大肠杆菌的分子鉴定产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致发达国家“旅行者腹泻”和发展中国家小儿腹泻的重要致病菌。本论文对分离自腹泻病人的123株ETEC进行多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析以确定它们的遗传相关性,并检测了这些菌株携带的毒力基因和对临床常用抗生素的耐药性。MLST和PFGE共鉴定出29个序列型和63个PFGE型,两种分型结果相关性较好。不同PFGE型的菌株所携带的肠毒素-定殖因子-染色体毒力因子的毒力基因谱有所不同。鉴定12株PFGE型SHNL0005、序列型ST 2332且血清型O128:H45的菌株与医院新生儿腹泻有关,该克隆系为多重耐药克隆系,可通过检测毒力基因STh,CS21,cly A,eat A和CFA/I进行鉴定。此外,序列型ST 182的9株菌为多重耐药菌株,至少对6种抗生素耐药。因此,序列型ST 2332和ST 182均为高风险克隆系。3、腹泻儿童弯曲菌分离株的流行和致病特征弯曲菌是细菌性肠炎的重要致病菌,由于儿童饮食结构与成人不同,他们是弯曲菌感染的一个特殊群体。本论文对五岁以下腹泻儿童中分离的110株弯曲菌(包括80株空肠弯曲菌和30株结肠弯曲菌)进行了检测,以确定它们的遗传相关性、耐药性、携带的毒力基因以及对人结肠癌细胞Caco-2的侵袭力。MLST分型显示,110株弯曲菌隶属于16个克隆群下的77个序列型,其中CC 464和CC 574为空肠弯曲菌的主要克隆群,CC 828为结肠弯曲菌的主要克隆群。弯曲菌对萘啶酸(88.2%)、环丙沙星(87.3%)和四环素(87.3%)的耐药率很高,此外,对氨苄青霉素(30.9%)、庆大霉素(28.2%)、克林霉素(21.8%)、红霉素(21.8%)和氯霉素(8.2%)也有耐药性。多重耐药的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌分别为32.5%和83.3%。其中,克隆群CC 828的16株结肠弯曲菌对6种抗生素均有抗性:环丙沙星-克林霉素-红霉素-庆大霉素-萘啶酸-四环素。大部分菌株携带了毒力基因cad F(100%)、ceu E(99.1%)、cia B(98.2%)、fla A(98.2%)、ans B(97.3%)、cdt B(96.4%)、cdt C(96.4%)和cdt A(94.6%),而毒力基因fuc P、vir B11和ggt携带率相对较低,分别为31.8%、1.8%和1.8%。根据基因型和携带毒力基因不同,挑选了57株弯曲菌检测对Caco-2细胞的黏附和侵袭力。不同菌株的黏附力差别不大,但侵袭力水平存在较大差异,鉴定出12个强侵袭力的序列型,如ST 21、ST 3930和ST 1953等。多重耐药菌株和对宿主细胞强侵袭力的菌株是潜在的高风险菌株,威胁儿童健康。4、多重耐药弯曲菌分离株的基因型特征本论文检测了2009-2014年从上海市腹泻病人和禽肉中分离的548株弯曲菌(包含372株空肠弯曲菌和176株结肠弯曲菌)对环丙沙星、四环素、庆大霉素、红霉素和克林霉素这五种临床常用抗生素的耐药性,分别筛选出对三种及三种以上抗生素耐药的多重耐药空肠弯曲菌32株(8.6%)和多重耐药结肠弯曲菌119株(67.6%)。PFGE分别鉴定出26个和77个不同的PFGE型,其中结肠弯曲菌的77个PFGE型可分为7个主要簇(簇A-G),簇A(n=16)和G(n=16)为最主要克隆系,分别包含了11株和8株同一PFGE型的菌株,表明这些克隆系可能通过交叉感染在人群中传播。鉴定了151株多重耐药菌株的耐药相关基因,gyr A基因86位密码子突变的菌株达到150株(99.3%);23s r RNA2075位碱基突变菌株56株(37.1%);携带erm B,tet(O),aad E基因和aad E-sat4-aph A基因簇的菌株分别有31株(20.5%)、148株(98%)、89株(58.9%)和10株(6.6%)。此外,空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的cme R-cme ABC转录间隔区序列有长度差别,回文序列区及附近序列鉴定出多个碱基突变,根据碱基突变,空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的转录间隔区分别鉴定出9和15个序列型,其中23个为新的序列型。