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目的:肺癌是世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。患者死亡的主要原因是肿瘤的复发与转移,即使Ⅰ期非小细胞肺癌,也有大约30％到40％的患者死于术后的肿瘤复发与转移。因此,对肺癌的诊断和预后评判的分子标志物及分子分期越来越受到研究者的重视。miRNA表达谱可以作为肺癌的诊断和预后分子标志物。最近的研究显示,miRNA-34家族表达受p53转录活性和DNA甲基化状态的直接调控。本研究的目的是miRNA-34家族的DNA甲基化与Ⅰ期非小细胞肺癌术后复发的相关性。
方法:1999至2005年,中国医学科学院肿瘤医院胸外科共收治非小细胞肺癌患者4702例,其中833例患者术后病理论断为Ⅰ期非小细胞肺癌,占全部病例的17.72％。入组本研究的所有Ⅰ期非小细胞肺癌患者术前及术后复发前均未进行辅助放化疗及生物治疗,围手术期死亡患者及术后非肿瘤原因死亡患者均未纳入本研究。共有161例符合本研究的入组条件。且可以从病理科获得石蜡包埋肿瘤组织,所有患者均随访满5年,术后复发病例均有明确影像学或病理学证据,死亡病例均是死于肿瘤及肿瘤引起的并发症。
161例Ⅰ期非小细胞肺癌的石蜡包埋肿瘤组织样本被纳入此研究,通过巢式甲基化特异PCR的方法,我们检测了其miR-34a与miR-34b/c的DNA甲基化状态。另外,通过相对定量RT-PCR的方法,我们检测了这批样本的成熟miR-34b与miR-34c的表达水平。
所有的统计分析都使用SPSS13.0软件进行。临床因素(性别,年龄,分期,病理类型,手术方法,吸烟史及肿瘤家族史)与肿瘤复发的相关性采用Chi-square t检验,同样的方法用于分析miR-34a及miR-34b/c甲基化状态与肿瘤复发的相关性。多因素logistic回归模型用于检验miR-34b/c甲基化状态与临床因素的关系。通过log-rank检验的Kaplan-Meier方法比较总生存时间与无病生存时间。Cox回归模型,用于检验总生存时间和无病生存时间与临床因素及miR-34b/c甲基化状态的相关性。甲基化组及非甲基化组的miR-34b/c的表达水平,通过非配对Wilcoxon(Mann-Whitney)检验。P<0.05认为具有统计学意义。
结果:全部161例样本DNA经重亚硫酸盐修饰后,通过巢式MSP进行扩增。其中98.1％(158/161)可以扩增出miR-34a,96.9％(156/161)可以扩增出miR-34b/c。对于miR-34a,其启动子区DNA甲基化率在复发组为39.2％(20/51),而在非复发组为35.5％(38/107)；对miR-34b/c,其启动子区DNA甲基化率在复发组为54.9％(28/51),而在非复发组为36.2％(38/105),miR-34b/c启动子区高甲基化与Ⅰ期非小细胞肺癌术后复发有明显相关性(p=0.026),而miR-34a与患者术后复发未发现明显相关性。
通过分析可以扩增出miR-34b/c的156例Ⅰ期非小细胞肺癌患者的术后总生存时间,及无病生存时间,发现非甲基化组预后明显好于甲基化组患者,总生存时间(p=0.010),无复发生存时间(p=0.017)。非甲基化组与甲基化组的术后中位总生存时间分别为56个月与51个月；非甲基化组与甲基化组的术后中位无复发生存时间分别为52个月与48个月。多因素回归分析显示,miR-34b/c甲基化状态是独立于分期,分化,病理类型,吸烟史等临床因素的总生存及无复发生存独立预后因素。
采用相对定量RT-PCR的方法,检测了可以扩增出miR-34b/c的156例Ⅰ期非小细胞肺癌组织样本的成熟miR-34b与miR-34c的表达水平。成熟miR-34b在甲基化组的中位相对表达水平为1.59,在非甲基化组的中位相对表达水平为1.85；成熟miR-34c在甲基化组的中位相对表达水平为1.64,在非甲基化组的中位相对表达水平为1.78。显示miR-34b/c启动子区甲基化对其成熟序列表达无影响。
通过定量RT-PCR方法检测了成熟miR-34b与miR-34c相对表达水平后,我们分析了其水平与Ⅰ期非小细胞肺癌术后生存的关系。在全部156例样本中成熟miR-34b的中位相对表达水平为1.72,据此将156例样本分为两组:相对表达大于1.72为miR-34b高表达组,相对表达低于1.72为miR-34b低表达组；同样地,在全部156例样本中成熟miR-34c的中位相对表达水平为1.76,据此将156例样本分为两组:相对表达大于1.76为miR-34c高表达组,相对表达低于1.76为miR-34c低表达组。通过log-rank检验的Kaplan-Meier方法比较总生存时间与无复发生存时间,我们发现成熟miR-34b与miR-34c相对表达水平与Ⅰ期非小细胞肺癌术后总生存时间及无复发生存时间无显著相关性。
结论:miR-34b/c甲基化状态与Ⅰ期非小细胞肺癌术后生存相关。miR-34b/c的DNA甲基化是Ⅰ期非小细胞肺癌的独立预后因素,miR-34b/c的DNA甲基化可以作为判断Ⅰ期非小细胞肺癌预后的潜在分子标志物。
miR-34a的DNA甲基化与Ⅰ期非小细胞肺癌术后复发无相关性。另外,未发现成熟miR-34b与maR-34c的表达水平与其DNA甲基化状态相关。