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吡咯喹啉醌是继烟酰胺、核黄素辅酶之后第三类辅酶,为B族维生素新成员,具有重要的生理功能,因此,大规模制备吡咯喹啉醌具有重要的意义。由于化学合成步骤多、产率低、异构体和副产品的去除需要多步纯化,且重金属催化剂不利于环境,生物合成吡咯喹啉醌是目前大规模制备最好的途径,为此,本课题主要研究了氧化葡糖杆菌合成吡咯喹啉醌的发酵条件、分离纯化及酶法合成的分子基础,具体如下:1、氧化葡萄糖酸杆菌发酵制备PQQ的条件研究用单因素试验和正交试验的方法对氧化葡萄糖酸杆菌发酵培养基进行优化,结果表明,氧化葡糖杆菌发酵制备PQQ的培养基成分最佳添加量为谷氨酸4g/L,酪氨酸4g/L,FeSO4?7H2O 5mg/L,此时合成PQQ最多为0.813ml/L,与理论预测值基本吻合。运用单因素分析方法进行了氧化葡萄糖酸杆菌发酵条件的优化,结果表明,pH值为6.5,发酵温度为28℃,发酵转速为200 r/min为最佳发酵条件。2、氧化葡萄糖酸杆菌发酵液中PQQ的分离纯化研究PQQ的结构中包含3个羧基,显色酸性。根据这个结构特点,采用络合萃取法对其进行分离纯化,发酵液经高速离心,将上清液在双溶质萃取体系进行络合萃取,其中三辛胺为络合剂,正己烷为稀释剂,得到富含吡咯喹啉醌的上层液,再用氨水反萃,减压浓缩后冷冻干燥,得到单一产物。经HPLC检测纯度可达到90%以上。该方法条件简单、过程快捷、便于大规模工业化生产。3、氧化葡萄糖酸杆菌PQQ合成基因簇的克隆与表达及酶法合成研究经过菌体发酵生产PQQ的尝试,我们进一步用单纯且可控的无细胞体系合成吡咯喹啉醌。LC-MS结果显示,PQQ是可以体外合成的,它的前体是多肽PqqA。在各种酶的作用下,PqqA经历了一系列变化最终生成PQQ,但是各种酶反应机制目前尚不清楚,有待进一步研究。为此,我们克隆和表达了氧化葡糖杆菌合成PQQ的基因簇各种酶的基因,并通过His-标签镍离子分离柱对粗蛋白进行纯化与浓缩,获得了重组菌种、重组质粒及酶等生物材料,尝试了酶法合成吡咯喹啉醌,该研究尚未取得结果。综合以上,通过本课题的研究获得了吡咯喹啉醌快速检测技术、发酵优化条件、快速分离纯化方法、以及合成PQQ基因重组质粒及酶蛋白,为研究吡咯喹啉醌的酶法合成打下坚实的基础。因此,本课题具有重要的理论价值和实际生产价值。