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本研究运用次抑菌浓度法在国际上首次成功地体外人工诱导出对头孢曲松稳定的高度耐药的淋球菌菌株，运用抑制性削减杂交分析诱导耐药前后淋球菌敏感株和耐药株之间的耐药相关基因并构建文库，运用基因芯片结合双色荧光技术验证耐药相关因并测序，基因序列输入GenBank行同源性分析，最终确定介导首株耐头孢曲松淋球菌人工诱导株对头孢曲松耐药的基因，阐明首株耐头孢曲松淋球菌人工诱导株耐药的分子机制。前瞻性地研究并阐明淋球菌耐头孢曲松的分子机制，从而制定出防止或延缓其耐药性产生的措施，对我国乃至全球淋病的预防和治疗将有十分重大的意义。
方法：
1.运用CRO次抑菌浓度法体外人工诱导对CRO敏感的淋球菌标准株ATCC49226、ATCC43069和临床株ZSSY00205、ZSSY00206，诱导过程运用生化和分子生物学试验监测其菌种特性。
2. 运用随机扩增多态性DNA(RAPD)分析淋球菌标准株ATCC49226和临床株ZSSY00205诱导前后菌株的基因组DNA差异。
3. 运用产色头孢菌素法纸片试验和药物水解试验检测淋球菌标准株ATCC49226 和临床株ZSSY00205诱导前后菌株产β-内酰胺酶情况。
4.运用纸片扩散法检测淋球菌标准株ATCC49226和临床株ZSSY00205诱导前后菌株对其他抗菌素的耐药性变化。
5.运用抑制性削减杂交(SSH)构建淋球菌标准株ATCC49226和临床株ZSSY00205诱导前后菌株的差异基因文库，并随机挑取50个克隆行基因测序及功能初筛。
6.运用基因芯片(DNA MicroArray)和双色荧光技术验证淋球菌标准株ATCC49226和临床株ZSSY00205诱导前后菌株的差异基因，标准组和临床组差异基因文库中分别随机挑取192个克隆作为探针制作基因芯片，Cy3、Cy5标记诱导前敏感株和诱导后耐药株DNA的RsaI酶切片断，杂交、洗片后行双色荧光扫描，挑取红色荧光克隆20个行基因测序及功能分析。
结果：
1. 淋球菌标准株ATCC49226、ATCC43069对于CRO的MIC值分别达到0.5μg/ml、0.25μg/ml，临床株ZSSY00205、ZSSY00206对CRO的MIC值分别达到32.0μg/ml、16.01.μg/ml，诱导过程中淋球菌标准株ATCC49226、ATCC43069和临床株ZSSY00205、ZSSY00206的生物学鉴定均表现为革兰阴性双球菌，氧化酶阳性，糖发酵见葡萄糖(+)、麦芽糖(-)、蔗糖(-)、乳糖(-)，分子生物学鉴定均表现为NspA基因阳性。
2. 诱导前后淋球菌标准株ATCC49226和临床株ZSSY00205的随机扩增多态性DNA(RAPD)图谱无明显差异。
3.诱导前后的淋球菌标准株ATCC49226和临床株ZSSY00205的产色头孢菌素法纸片试验均为阴性，药物水解试验未见指向氨苄西林(AMP)、头孢曲松(CRO)药敏纸片的突出菌苔。
4.诱导后耐CRO的淋球菌标准株ATCC49226和临床株.ZSSY00205较诱导前CRO敏感株对青霉素、四环素、阿奇霉素、环丙沙星的抑菌环直径均有降低。
5.成功地构建了淋球菌ATCC49226标准组和ZSSY00205临床组的差异基因文库，在ATCC49226标准组筛选出17个功能性差异基因，在ZSSY00205临床组筛选出22个功能性差异基因。
6.基因芯片结合双色荧光技术确定了包括mtrR、mtrC、gyrB、rpsJ、pJD1在内的多个耐药基因，并发现2个不能与淋球菌基因组序列相匹配的新基因(分别与脑膜炎萘瑟菌血清型A、霍乱弧菌l型生物变种有较大的同源性)。
结论：
1.CRO次抑菌浓度法可诱导CRO敏感的淋球菌标准株ATCC49226、ATCC43069和临床株ZSSY00205、ZSSY00206成为稳定的高度耐CRO菌株，虽历经漫长的诱导过程，各菌株的种属特性未发生改变。
2.诱导前后淋球菌标准株ATCC49226和临床株ZSSY00205的基因组DNA未发生较大的改变。
3.诱导前后的淋球菌标准株ATCC49226和临床株ZSSY00205既不表达青霉素酶，也不表达ESBL或AmpC酶。
4.淋球菌标准株ATCC49226和临床株ZSSY00205对CRO耐药的同时均伴有对青霉素、四环素、阿奇霉素、环丙沙星等抗菌素耐药性的增加，提示多重耐药，可能与染色体介导的多基因突变有关。
5.综合抑制性消减杂交(SSH)初筛结果和基因芯片(DNAMicroArray)验证结果分析，淋球菌对CRO的耐药机制主要与mtrR、mtrC、gyrB、rpsJ、pJD1等突变有关，通过外排泵活性增强、抗生素结合位点改变等机制介导耐药。