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背景与目的B淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤是原发于骨髓造血系统和淋巴结并弥漫全身的恶性肿瘤。传统的放化疗对于早、中期患者疗效满意,但对于晚期患者则疗效欠佳,尤其是病理分级较低的患者比如慢粒或套细胞淋巴瘤。近年来,基于抗体的生物治疗因为其特异靶向性、高亲和性收到了良好效果。微型双功能抗体是继单克隆抗体之后一种新型抗体药物,它是基因工程抗体的一种形式,仅由抗体的VL和VH片段构成,通常是抗XAVL／抗XBVH片段和抗XBVL／抗XAVH片段之间通过分子间力形成二聚体,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用。CD19分子表达于干细胞外的B淋巴细胞发育的各个阶段,B细胞来源的恶性肿瘤均有表达,CD3分子表达于T细胞和NK细胞,本实验基于此构建抗CD3／抗CD19 (Diabody)微型双功能抗体,并且为增强其稳定性进一步改造为二硫键稳定的抗CD3／抗CD 19 (ds-Diabody)微型双功能抗体,表达并纯化后测定它们体内外生物学活性和介导效应细胞杀伤靶细胞的作用。方法用重叠PCR (Overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3／抗CD19表达载体pAYZCD3CD19,再用PCR法通过引物在抗CD3VL-100位和抗CD3VH-44位引入半胱氨酸突变,构建二硫键稳定的抗CD3／抗CD 19表达载体pAYZdsCD3CD19,转化感受态大肠杆菌16C9进行原核表达。表达产物经6×His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及westen-blot鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测双功能抗体与CD19+Raji细胞和CD3+Jurkat细胞的结合活性,将2种双功能抗体在0.2%的人血清白蛋白中37℃温育不同时间点至72h后,通过间接免疫荧光法FACS检测其结合活性,并比较二者的稳定性。利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性检测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞作为效应细胞,首先以Raji细胞为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度设组,以PBS,抗CD3scFv+抗CD3scFv抗体及抗CD3／抗Pgp双功能抗体为对照,另设CD19-k562细胞为非相关靶细胞组,比较双功能抗体介导特异性体外杀伤活性。取上述杀伤实验效靶比25：1,抗体浓度500ng/ml各组,ELISA法比较激活的T细胞分泌IL-2,IL-4的量,FACS检测T细胞表面标记CD25和CD69激活后的表达变化,实时定量PCR检测各组穿孔素(Perforin)和颗粒酶A (GranzymeA)的释放,FACS检测T细胞凋亡的变化。建立Balb/c裸鼠Raji细胞移植瘤模型,以PBL联合Diabody及ds-Diabody间隔7天尾静脉给药一次,共给药3次,Diabody和ds-Diabody设立3个浓度梯度,并以PBS, PBL,抗CD3scFv+抗CD19scFv抗体及抗CD3／抗PgP抗体为对照,建立k562细胞移植瘤模型作为非相关细胞对照组,观察抗体体内毒性反应,根据肿瘤大小计算抑瘤率,评价疗效。取不同终浓度的抗代谢类化疗药阿糖胞苷(Ara-C),作用Nalm6细胞72h,FACS测定CD80和CD86表达。取不同终浓度Ara-C作用Nalm6细胞72h,MTT法检测Ara-C对Nalm6的抑制率。确定使Nalm6细胞CD80和CD86表达升高但又不产生抑制效果的Ara-C终浓度。Calcein-AM法测定双功能抗体联合Ara-C或单独介导T细胞的体外杀伤活性,并测定激活的T细胞分泌IL-2, IL-4的量,表面标记CD25和CD69的表达变化,Perforin和GranzymeA的释放,以及T细胞凋亡的变化,具体方法同前。结果基因重组质粒pAYZCD3CD19和PAYZdsCD3CD19经测序证实序列正确,构建成功。Diabody和ds-Diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达,表达产物经6×His-tag蛋白纯化柱纯化,浓缩后产量均为约5mg/L。12%SDS-PAGE显示Diabody在28kD和26kD各有一条带,western-blot在28kD显示有带,与理论相符。ds-Diabody非还原性SDS-PAGE中,在45kD可见1条带(空间构象使电泳分子量小于实际分子量),western-blot在同一位置显示有带；还原性SDS-PAGE显示45kD消失,在28kD和26kD各有一条带,western-blot在28kD显示有带,这些均与理论相符,45kD为二硫键稳定的二聚体,在还原剂巯基乙醇作用下二硫键断开,形成28kD和26kD的2条带。表达产物经纯化定量均可达5mg/L。FACS检测Diabody和ds-Diabody可与CD19+Raji细胞和CD3+Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制单抗HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合。体外血清稳定性实验ds-Diabody37℃72h后活性基本不变,而Diabody则递减至消失,证明ds-Diabody比Diabody更加稳定。Diabody和ds-Diabody体外介导T细胞杀伤靶细胞Raji的效果比对照组明显(p<0.05),激活T细胞分泌IL-2、IL-4,释放Perforin和GranzymeA的量及CD25和CD69的表达均明显高于对照组,T细胞凋亡率低于对照组(p<0.05), Diabody和ds-Diabody均能有效抑制移植瘤的生长(p<0.05),而ds-Diabody介导的抑制作用较Diabody增强近1倍。终浓度为0.25μmol/l Ara-C使Nalm6细胞CD80(B7.1)表达升高,而CD86(B7.2)表达不变,该浓度不会产生对Nalm6的抑制作用。Diabody和ds-Diabody体外介导T细胞杀伤Nalm6 (Ara-C)的效果比Nalm6明显(p<0.05), Nalm6 (Ara-C)组激活T细胞分泌IL-2, IL-4,释放Perforin和GranzymeA的量及CD25和CD69的表达均明显高于Nalm6组(p<0.05),而T细胞凋亡率低于Nalm6组(p<0.05)结论本实验成功构建了抗CD3／抗CD19和二硫键稳定的抗CD3/抗CD19微型双功能抗体,改造后的二硫键稳定的抗CD3／抗CD19双功能抗体抗原结合活性和体外介导T细胞发挥杀伤效应的能力没有明显改变,而体内稳定性大大增强,介导T细胞杀伤移植瘤的作用增强近1倍；非抑制剂量化疗药阿糖胞苷使Nalm6细胞CD80表达升高,联合双功能抗体使体外介导T细胞杀伤靶细胞Nalm6的效果提高近20%。